市售白花蛇舌草药材的DNA条形码鉴定研究△

闫嵩，任伟超，郑希龙，杨毅，潘勃，师玉华，孙伟*，马伟*

(1.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；3.中国医学科学院 药用植物研究所海南分所，海南 万宁 571533；4.中国医学科学院 药用植物研究所重庆分所，重庆 南川 408435；5.中国科学院西双版纳热带植物园，云南 昆明 650223)

·专题·

市售白花蛇舌草药材的DNA条形码鉴定研究△

闫嵩1，2，任伟超1，郑希龙3，杨毅4，潘勃5，师玉华2，孙伟2*，马伟1*

(1.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；3.中国医学科学院 药用植物研究所海南分所，海南 万宁 571533；4.中国医学科学院 药用植物研究所重庆分所，重庆 南川 408435；5.中国科学院西双版纳热带植物园，云南 昆明 650223)

目的：基于ITS2序列检测市场药材白花蛇舌草，为白花蛇舌草药材鉴定提供一种新的分子手段。方法：实验获取白花蛇舌草及其常见混伪品基原植物ITS2序列，结合GenBank下载序列共7个物种53条序列。经CodonCode Aligner V3.7.1拼接，利用MEGA 6.0软件进行变异位点分析，遗传距离计算和构建邻接(NJ)系统发育聚类树。同时随机检测37份市场药材白花蛇舌草，经中药材DNA条形码鉴定系统进行序列比对并构建邻接(NJ)系统聚类树确定物种，鉴别真伪。结果：白花蛇舌草基原植物ITS2序列种内K2P平均遗传距离远小于其与混伪品种间K2P平均遗传距离，NJ树结果表明白花蛇舌草基原植物可与其混伪品明显区分；市场药材中正品29份，伪品8份，其中半枝莲和远志为新发现的伪品。结论：基于ITS2 序列DNA条形码技术可有效准确鉴定白花蛇舌草及其混伪品，为其用药安全提供了有力保障。

白花蛇舌草；ITS2；DNA条形码；鉴定

白花蛇舌草又名蛇舌草、矮脚白花蛇利草、蛇舌癀等，生于潮湿的田边、沟边、路旁和草地，分布于我国东南至西南部各地，其味苦、甘，性寒；归心、肝、脾、大肠经[1]。《中华人民共和国药典》2010版一部附录拟定其来源为茜草科植物白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa(Willd.)Roxb.(中国植物志为茜草科耳草属HedyotisdiffusaWilld.)的干燥全草。白花蛇舌草具有清热解毒、利尿消肿、活血止痛、抗菌消炎和抗肿瘤等功效[2]，其中成药白花蛇舌草注射液已被国内多个厂家生产，用于湿热蕴毒所致的呼吸道感染，扁桃体炎，肺炎，胆囊炎，阑尾炎，痈疖脓肿及手术后感染，亦可用于癌症辅助治疗。

调查发现市场上白花蛇舌草常见的混伪品主要有伞房花耳草、鹅不食草、漆姑草、雀舌草、地锦草、仙桃草等，药材形态特征有限，难以从外观上准确快速鉴定，因此白花蛇舌草伪品混用误用现象比较明显[3-5]，使得药材质量以及用药安全得不到保证，因此急需一种准确快速鉴定白花蛇舌草的新方法。

DNA条形码是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的一种分子诊断新技术，是近年来生物分类和鉴定的研究热点[6-9]。在植物鉴定方面，Chen等[10]以药用植物及其密切相关物种为研究对象，分析比较筛选大量样本基因序列，结果表明ITS2表现突出，在物种水平的鉴定效率高达92.7%，适合于中药材等存在DNA降解的材料，明显优于国际生命条形码联盟推荐的400-800 bp叶绿体序列rbcL和matK联合条形码，故将ITS2序列作为药用植物鉴定的通用条形码序列[11-15]。目前，该方法在羌活、赤芍、麻黄、党参、红景天、马兜铃等药材鉴定上得到了很好的验证[16-21]。同时，陈士林团队建立了中药材DNA条形码数据库(http：//www.tcmbarcode.cn)，其鉴定核心数据库共包含数万物种，超过十万条序列，涵盖《中华人民共和国药典》2010版收录的几乎所有动植物药材及其常见混伪品，同时包含日本、韩国、印度、美国和欧洲药典95%以上的药材。为确保样品的准确性和代表性，样品采集尽量覆盖药材原产地、主产地及其主要分布区，并由国内外权威专家采用经典分类方法确定其基原[11]。本实验基于ITS2序列建立白花蛇舌草DNA条形码鉴定方法，同时检测全国市场药材，验证该方法的稳定性和准确性，确保白花蛇舌草的用药安全。

1 材料

本实验选用白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa、伞房花耳草Oldenlandiacorymbosa、鹅不食草Centipedaminima、漆姑草Saginajaponica、雀舌草Stellariaalsine、地锦草Euphorbiahumifusa、仙桃草Veronicaanagallis-aquatica共7个物种45份基原植物，采集于中国医学科学院药用植物研究所海南分所、重庆分所、广西分所，中国科学院西双版纳植物园、华南植物园。凭证标本保存于中国中医研究院中药研究所，并从GenBank上下载8条ITS2序列(登录号为HQ148830，HQ148798，HQ148799，HQ148800，HQ148801，HQ148802，KJ630576，KJ630577)。详细信息见表1，表2。

表1 基原物种信息

表2 GenBank下载序列

2 方法

2.1 DNA的提取

取白花蛇舌草及混伪品植物样本40 mg，用高通量组织球磨仪50 Hz研磨120 s后，用植物组织DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取总DNA。期间加入700 μL DNA裂解液，56 ℃水浴过夜。

2.2 PCR扩增及测序

植物类中药材及其基原物种ITS2序列通用引物：正向引物：ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR反应体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，正反向引物(2.5 μmol·L-1)各1ul，DNA2ul，加ddH2O至25 μL。扩增程序：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(经过40个循环)；最后72 ℃延伸10 min[22]。PCR产物取3 μL，以0.5×TAE电泳缓冲液进行凝胶电泳，扩增成功的产物送北京美吉生物医药科技有限公司双向测序。

2.3 数据分析

测序结果运用Codoncode Aligner V3.7.1进行校对拼接，去除引物区。基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除5.8S和28S[23]，得到ITS2序列。用软件MEGA 6.0把所得序列进行分析比对[24]，基于K2P模型计算遗传距离，邻接(NJ)法构建系统发育聚类树，采用自举检验法bootstrap重复1000次检验各个分支的支持率。

3 基原物种鉴定结果分析

3.1 白花蛇舌草的种内变异分析

白花蛇舌草ITS2序列比对后长度为214 bp，种内存在两条变异位点，位置分别为94 bp，173 bp处，分为三种单倍型，平均GC含量为66.4%，A1单倍型4条，同GenBank KT284787；A2单倍型3条，同GenBank KT284788；A3单倍型3条，同GenBank KT284791(表3)。

表3 白花蛇舌草种内变异

3.2 白花蛇舌草及其混伪品的种内种间遗传距离分析

基于K2P模型计算白花蛇舌草与其混伪品K2P距离，白花蛇舌草的种内K2P平均距离为0.0044，种内最大K2P遗传距离为0.0094。白花蛇舌草与其伪品伞房花耳草、鹅不食草、漆姑草、雀舌草、地锦草、仙桃草的种间最小遗传距离分别为0.2895，0.5767，0.7429，0.6639，0.7093，0.4573，均远大于白花蛇舌草种内最大遗传距离，表明ITS2序列能准确区分白花蛇舌草及其混伪品(表4)。

表4 白花蛇舌草种内遗传距离及其与混伪品的种间遗传距离

3.3 白花蛇舌草及其混伪品的NJ树鉴定

基于得到的53条ITS2序列，用邻接(NJ)法构建白花蛇舌草和其混伪品的系统聚类树。从所构建的NJ树中可以看出，白花蛇舌草序列单独聚为一支，混伪品物种也能单独聚为一支，呈现良好的单系性且自展支持率都大于95%(图1)。

4 市场药材白花蛇舌草鉴定结果分析

从安徽亳州药市，河北安国药市，成都莲花池药市，哈尔滨，湖北，河南，北京，辽宁，江西药店共收集药材白花蛇舌草37份(编号SCBH01-SCBH37)，用上文同样方法得到ITS2序列，并到中药材DNA条形码鉴定系统(http：//www.tcmbarcode.cn/china/)比对，鉴定结果见表5。

对37份市场药材序列比对发现共有白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa29份，伞房花耳草Oldenlandiacorymbosa4份，鹅不食草Centipedaminima1份，发现新伪品2种，半枝莲Scutellariabarbata2份，远志Polygalatenuifolia1份。伪品占抽样调查的21.6%。

根据以上序列的比对结果，将37份市场药材(包括新伪品)和前文白花蛇舌草及其混伪品基原物种的ITS2序列一起构建NJ树(图2)。结果可以看出，29份药材与白花蛇舌草基原聚成一枝，4份与伞房花耳草聚成1枝，1份与鹅不食草构成一枝，2种新伪品也能单独的聚成一枝，物种鉴定结果与中药材DNA条形码鉴定系统鉴定结果相同，表明基于ITS2 DNA条形码技术能很好的鉴定药材白花蛇舌草。

注：Bootstra P1000次重复，枝上数值仅显示自展支持率≥50%图1 基于ITS2序列构建白花蛇舌草及其混伪品邻接(NJ)树

表5 市场药材白花蛇舌草鉴定结果

表5(续)

注：Bootstra P1000次重复，枝上数值仅显示自展支持率≥50%图2 基于ITS2序列构建的市场药材白花蛇舌草和已知基原物种的邻接(NJ)树

5 讨论

DNA条形码技术的兴起及成熟，解决了传统中药鉴定方法主观性强、重复性和稳定性差的缺点[25]，一个准确全面的中药DNA条形码数据库建立显得尤其重要，应可方便快捷对中药资源信息检索、查询以及物种比对鉴定，目前，陈士林团队已建立了全世界最大的中草药DNA条形码鉴定数据库和中药材DNA条形码鉴定系统网站http：//www.tcmbarcode.cn，为广大科研工作者直接应用DNA条形码技术鉴定中药材搭建了一个平台。

白花蛇舌草作为传统中药材，拥有良好的药用价值，市场及临床需求量大，但其野生药材资源不断减少，家种商品不多，与其外观形态相似的伪品又多，使得混用误用现象不断增加，严重影响用药疗效与安全，有关部门应提高白花蛇舌草药材监管力度，确保药材的质量与规范化使用。虽然传统方法如从植物形态、性状、显微方面能够辨别真伪[3-5]，但对操作者的专业知识要求较高，且伴有较强的主观性，本研究证实了运用DNA条形码技术鉴定市场药材白花蛇舌草的可行性。实验过程中应避免污染，并要保证提取DNA的浓度，本实验涉及的7种原植物和药材用通用引物ITS2F/3R有很好的扩增效率，PCR电泳后均呈现清晰条带。白花蛇舌草及其混伪品基原物种最近距离法和NJ树鉴定均表明ITS2序列在物种间的鉴定能力，能将白花蛇舌草及其混伪品很好鉴定开，于此基础上再对市场药材白花蛇舌草进行比对鉴定和结合已知基原物种序列建立NJ树确定物种基原。37份市场药材中正品29份，伪品8份，正品率为78.4%，需要提及的是，伪品中还检测出两种新伪品半枝莲和远志，NJ树上也能独自聚为一枝，表现良好的单系性。综上，应用ITS2序列可以准确鉴定白花蛇舌草药材及其混伪品，且建立的白花蛇舌草DNA条形码鉴定方法可对市售白花蛇舌草进行鉴定。

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SurveyofCommerciallyAvailableOldenlandiadiffusaProductsUsingDNABarcoding

YANSong1，2，RENWeichao1，ZHENGXilong3，YANGYi4，PANBo5，SHIYuhua2，SUNWei2*，MAWei1*

(1.PharmacyCollege，HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040，China；2.InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；3.HainanBranchofInstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcadenyofMedicalSciences，Wanning571533，China；4.ChongqingBranchofInstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcadenyofMedicalSciences，Nanchuan408435，China；5.XishuangbannaTropicalBotanicalGarden，ChineseAcademyofSciences，Kunming650223，China)

Objective：To provide a new molecular method for the identification ofOldenlandiadiffusa，based on internal transcribed spacer 2 (ITS2) sequence.Methods：Combined with the sequences downloaded from GenBank，total 53 sequences ofO.diffusaand its adulterants were obtained representing total 7 species.After sequences were assembled by Codoncode Aligner V3.7.1，MEGA 6.0 software was used for analyzing mutation loci，computing the genetic distances and building neighbor-joining(NJ) phylogenetic tree.Simultaneously，37 randomO.diffusafrom markets were detected by Chinese herbal medicine DNA barcode identification system.The species were determined by NJ tree and Blast1 methods.Results：The results revealed that the intraspecific genetic distances ofO.diffusawere lower than the interspecific genetic distances betweenO.diffusaand its adulterants.The NJ tree strongly supported thatO.diffusaand its adulterants can be differentiated.29 samples ofO.diffusacollected from markets are genuine，8 samples are counterfeit.ScutellariabarbataandPolygalatenuifoliawerereportedasnewadulterants.Conclusion：The ITS2 sequences of DNA barcoding can identifyO.diffusafrom its adulterants accurately and effectively，which provide a strong guarantee for the safety of the drug.

Oldenlandiadiffusa；ITS2；DNA barcoding；identification

2015-08-06)

林业公益性行业科研专项(201004079，201404718)；重大新药创制国家科技重大专项(2014ZX09304307001)

*

马伟，研究员，研究方向：药用植物生物工程；E-mail：mawei@hljucm.net； 孙伟，助理研究员，研究方向：中药资源与分子鉴定；E-mail：wsun@icmm.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.005