HPLC-DAD法同时测定黄芪护肝丸中5种活性成分的含量

米振清，刘斌，2*

(1.山东省泰安市食品药品检验检测中心，山东 泰安 271000； 2.泰山医学院，山东 泰安 271000)

·中药工业·

HPLC-DAD法同时测定黄芪护肝丸中5种活性成分的含量

米振清1，刘斌1，2*

(1.山东省泰安市食品药品检验检测中心，山东 泰安 271000； 2.泰山医学院，山东 泰安 271000)

目的：建立高效液相色谱法同时测定黄芪护肝丸中芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素和大黄酚5种活性成分含量的方法。方法：采用ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相：甲醇(A)-0.1%磷酸的水溶液(B)，梯度洗脱；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：芍药苷为230 nm，橙皮苷和五味子醇甲为217 nm，大黄素和大黄酚为254 nm。结果：芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素和大黄酚的线性范围分别为5.12～102(r=0.999 6)、10.4～207(r=0.999 8)、2.58～51.6(r=0.999 7)、3.22～64.4(r=0.999 8)、2.45～49.0 μg·mL-1(r=0.999 8)，平均加样回收率(n=6)分别为98.6%、99.2%、98.9%、98.3%、98.3%，RSD分别为1.1%、1.0%、1.3%、1.2%、1.2%。结论：本法专属性强，结果准确，重复性好，可用于黄芪护肝丸的质量控制。

高效液相色谱-二极管阵列检测器；黄芪护肝丸；芍药苷；橙皮苷；五味子醇甲；大黄素；大黄酚；含量

黄芪护肝丸是在中医临床验方和现代中药药理学研究基础上由黄芪、赤芍、陈皮、五味子、大黄等16味中药组成的水丸，具有清热解毒、益气活血、保肝护肝之功能，用于甲肝或乙肝的治疗。其中，黄芪具有补气升阳、益卫固表的作用，其有效成分黄芪甲苷具有抗血栓、抗肿瘤、保肝等作用[1]；赤芍具有清热凉血、散瘀止痛的作用，其有效成分芍药苷具有镇痛、镇静、舒张平滑肌的作用[2]；陈皮具有理气健脾、燥湿化痰的作用，橙皮苷具有降脂、抗血栓、抗肿瘤等作用[3]；五味子具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的作用，其有效成分五味子醇甲具有保肝护肝，促进肝糖原合成等作用[4]；大黄具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的作用，大黄素和大黄酚具有泻下、抗炎、降压、降血脂等作用[5-6]。目前对于上述几种成分的含量测定方法的报道较多[7-14]，除黄芪甲苷的含量测定采用高效液相-蒸发光散射检测器检测外，其余成分的含量测定方法皆为高效液相-紫外检测器检测，且未见关于黄芪护肝丸多成分含量测定方法的研究。本研究以赤芍中的芍药苷、陈皮中的橙皮苷、五味子的五味子醇甲、大黄中的大黄素和大黄酚为定量指标，根据5种成分紫外吸收特征的不同，采用高效液相色谱-二极管阵列检测器检查法，在3个紫外波长下同时对黄芪护肝丸中的5种成分的含量测定方法进行研究。结果表明，本法专属性强，结果准确，重复性好，可为黄芪护肝丸的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪、SPD-M20A二极管阵列检测器、LC solution色谱工作站(日本岛津公司)；十万分之一电子天平(Mettler Toledo XS205DU)。

1.2 试药

芍药苷对照品、橙皮苷对照品、五味子醇甲对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110736-201438，110721-201316，110857-201010，110756-201110，110796-201319)；黄芪护肝丸(自制，每20丸重1 g，批号分别为20140801，20140802，20140803)；甲醇为色谱纯；磷酸为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～10 min，35%A；10～15 min，35%～60%A；15～35 min，60%A；35～40 min，60%～80%A；40～60 min，80%A；60～65 min，80%～35%A；65～70 min，35%A)；检测波长：芍药苷为230 nm，橙皮苷和五味子醇甲为217 nm，大黄素和大黄酚为254 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。芍药苷、橙皮苷、五味子醇苷、大黄素和大黄酚的分离度均大于1.5，理论板数按橙皮苷色谱峰计算应不低于6000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素和大黄酚对照品适量，分别加甲醇制成质量浓度分别为512、1036、258、322、245 μg·mL-1的对照品储备液。再分别精密量取储备液1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇制成每mL中分别含芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素、大黄酚51.2、104、25.8、32.2、24.5 μg的混合对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取本品100丸，研细，混匀，取约2.0 g，精密称定。置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率为300 W，频率为50 KHz)30 min，取出，放冷，再称定重量。用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性供试品溶液 按黄芪护肝丸处方比例，分别制备不含赤芍、陈皮、五味子、大黄的黄芪护肝丸阴性样品，按2.2.2项下的方法制备阴性供试品溶液。

2.3 空白试验

按2.1色谱条件，分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液依法测定，记录色谱图。结果表明，供试品溶液中芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素和大黄酚的色谱峰与对照品溶液保留时间一致，阴性供试品溶液在与芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素和大黄酚对照品相同保留时间处无干扰峰，处方中其他药味对测定结果无影响。HPLC图谱见图1～6。

注：1.芍药苷；2.橙皮苷；3.五味子醇甲；4.大黄素；5.大黄酚。下同。图1 对照品HPLC图

图2 样品HPLC图

图3 缺赤芍阴性对照样品HPLC图

图4 缺陈皮阴性对照样品HPLC图

图5 缺五味子阴性对照样品HPLC图

图6 缺大黄阴性对照样品HPLC图

2.4 线性关系考察

精密量取2.2.1项下芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素和大黄酚对照品储备液各0.1、0.2、0.5、1、2 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成不同浓度的混合对照品溶液，依法测定。以质量浓度X(μg·mL-1)对峰面积Y进行线性回归，回归方程分别为芍药苷：Y=3.879×104C+8.463×103(r=0.999 6)；橙皮苷：Y=2.168×104X+1.273×104(r=0.999 8)；五味子醇甲：Y=7.342×104X+5.732×103(r=0.999 7)；大黄素：Y=2.469×104X+6.056×103(r=0.999 8)；大黄酚：Y=3.096×104X+1.335×103(r=0.9998)，芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素和大黄酚的线性范围分别为5.12～102、10.4～207、2.58～51.6、3.22～64.4、2.45～49.0 μg·mL-1。

2.5 精密度试验

取2.2.1项下混合对照品溶液，按2.1色谱条件连续进样6次，测定峰面积，以峰面积考察精密度，芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素和大黄酚峰面积的RSD分别为0.62%、0.81%、0.63%、0.62%和0.70%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取黄芪护肝丸(批号：20140801)，按2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，依2.1色谱条件进行测定，结果芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素和大黄酚的平均质量分数分别为0.98、2.2、0.50、0.68、0.50 mg·g-1，RSD分别为1.5%、1.4%、1.3%、1.3%和1.5%，表明该方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验

取黄芪护肝丸(批号：20140801)，按照2.2.2项下方法制备的供试品溶液，依2.1色谱条件分别在供试品溶液制备后的0、2、4、6、8、10、12 h进行测定，结果芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素和大黄酚峰面积的RSD分别为1.1%、1.5%、1.2%、1.0%和1.1%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 加样回收试验

取已知含量的黄芪护肝丸(20140801)适量，研细，称取约1.0 g，共6份，精密称定，分别精密加入2.2.2项下的芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素和大黄酚对照品储备液2.0 mL，照2.2.2项下方法制备供试品溶液，依2.1色谱条件测定，分别计算各成分加样回收率，结果见表1。表明该方法的准确度良好。

表1 加样回收试验结果(n=6)

2.9 样品测定

取本品3批样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件测定，用外标一点法分别计算样品中芍药苷、橙皮苷、五味子醇甲、大黄素和大黄酚的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3) /mg·g-1

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的考察

本研究分别采用超声和回流提取方法，分别以甲醇、70%甲醇溶液、50%甲醇溶液为溶媒，分别超声处理15、30 min以及加热回流30、60 min，制备供试品溶液。比较发现，5种待测成分在甲醇溶液中超声提取30 min提取效果较好，杂质干扰少，且操作简便，节约时间。

3.2 检测波长的选择

由于5种成分的紫外光谱差异较大，为了能同时检测5种活性成分，采用二极管阵列检测器，多波长同时检测各成分的含量。芍药苷在230 nm处有最大吸收，且吸收值高，分离度好，故选择此波长检测；橙皮苷在207、284 nm处有特征吸收，且灵敏度高，无干扰峰；五味子醇甲在217、252 nm处有特征吸收，但均在217 nm处有较大吸收，因此选择217 nm作为橙皮苷和五味子醇甲共同的测定波长；大黄素和大黄酚共有的特征吸收均为254、266、288 nm，因均在254 nm处有较大吸收，且灵敏度高，无干扰峰，因此选择254 nm作为共同的测定波长。

3.3 流动相的选择

笔者参照相关文献[8-14]，分别比较了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液和甲醇-2%醋酸溶液3种不同的流动相。结果发现以甲醇-0.1%磷酸为流动相，采用梯度洗脱的方法，5种待测活性成分的峰形及分离度均良好，保留时间适宜。使用本法测定的专属性强，结果准确，重复性好，可结合黄芪护肝丸中黄芪甲苷的含量测定方法综合评价黄芪护肝丸的质量。

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SimultaneousDeterminationofFiveKindsofComponentsinHuangqihuganPillsbyHPLC-DAD

MIZhenqing1，LIUBin1，2*

(1.TaianTestingCenterforFoodandDrugControl，Taian271000，China； 2.TaishanMedicalUniversity，Taian271000，China)

Objective：To establish an HPLC method for determination of five bioactive components in Huangqihugan pills，including paeoniflorin，hesperidin，schisandrin、emodin and chrysophanol.Methods：A stable HPLC method was established on a ZORBAX SB-C18column，the mobile phase consisted of methanol (A)-0.1% (w) phosphoric acid(B) as mobile phase in a gradient mode.The flow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was set at 30 ℃.The detection wavelength was set at 230 nm for paeoniflorin，217 nm for hesperidin and schisandrin，254nm for emodin and chrysophanol，respectively.Results：The linear ranges of paeoniflorin，hesperidin、schisandrin、emodin and chrysophanol were 5.12-102 (r=0.999 6)，10.4-207(r=0.999 8)，2.58-51.6(r=0.999 7)，3.22-64.4(r=0.999 8) and 2.45-49.0 μg·mL-1(r=0.999 8)，respectively.The average recovery were 98.6%、99.2%、98.9%、98.3% and 98.3%，repectively.RSD were 1.1%、1.0%、1.3%、1.2% and 1.2%，respectively.Conclusion：The established method is specific，accurate and reproducible，which can be used for the quality control of Huangqihugan pills.

HPLC-DAD；Huangqihugan pills；paeoniflorin；hesperidin；schisandrin；emodin；chrysophanol； content

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.022

2014-12-25)

*

刘斌，主管药师，研究方向：中药质量控制；Tel：(0538)8334565，E-mail：liubin8247@sina.com