四倍体金银花药材体外抗菌抗病毒实验研究△

胡璇，李卫东，贾翎，张硕峰，吴珺，邱泽计，曾郁敏

(1.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南 儋州 571737； 2.北京中医药大学 中药学院，北京 100102； 3.北京中医药大学 中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 100102； 4.北京中医药大学 基础医学院，北京 100029)

·基础研究·

四倍体金银花药材体外抗菌抗病毒实验研究△

胡璇1，李卫东2，3*，贾翎4*，张硕峰2，吴珺4，邱泽计4，曾郁敏4

(1.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南 儋州 571737； 2.北京中医药大学 中药学院，北京 100102； 3.北京中医药大学 中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 100102； 4.北京中医药大学 基础医学院，北京 100029)

目的：研究四倍体金银花的体外抗菌和抗病毒作用。方法：以二倍体金银花为对照，用最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度法(MBC)测定四倍体金银花水提物对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念球菌、肺炎克雷伯菌的抗菌和杀菌作用。采用细胞病变效应法(CPE)观察四倍体金银花水提物对狗肾传代细胞(MDCK)的最大无毒浓度(TC0)和半数中毒浓度(TC50)。将100TCID50的甲型流感病毒FM1加入MDCK细胞培养板中，吸附1 h后弃病毒液于MDCK细胞培养板中加入四倍体金银花水提液的最大无毒浓度稀释液，通过CPE法观察提取物对病毒致细胞病变作用的影响。结果：四倍体金银花水提物对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念球菌、肺炎克雷伯菌均具有抑菌和杀菌作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌和杀菌作用最为明显，四倍体对乙型链球菌抑菌强度高于二倍体，对肺炎克雷伯菌的杀菌强度高于二倍体。四倍体金银花水提物在浓度为0.030 5 mg·mL-1对甲型流感病毒FM1所致的细胞病变作用显示抑制作用，而其对照药材二倍体金银花水提物在浓度为0.488 0、0.244 0 mg·mL-1对流感病毒所致的细胞病变作用显示抑制作用。结论：四倍体金银花具有体外抗菌及抗流感病毒的作用。

四倍体金银花；抗菌作用；甲型流感病毒FM1；抗病毒作用

金银花(Lonicerae Japonicae Flos)为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，其味甘、性寒[1]，具有清热解毒、凉散风热的功能。金银花是清热解毒的传统药物，用药历史悠久，临床上广泛应用于急性热病及外科感染性疾病，如上呼吸道感染、急性扁桃体炎、咽炎、乳腺炎、痢疾疖疮痛肿等[2]。金银花为常用大宗药材，尤其是我国出现的非典型肺炎曾一度让金银花药材供不应求。

针对目前金银花优良品种少、产量低等问题，笔者课题组以二倍体忍冬为亲本，采用秋水仙素诱导培育而成了四倍体忍冬品种——“九丰一号”，该品种金银花具有有效成分含量高[3]、产量高、采摘省工、抗逆性强[4-5]等特点，迅速在全国大面积推广种植，所产药材也已销往全国各地。目前药用植物多倍体研究多集中在多倍体诱导及其化学成分或营养成分上，如百合[6]、连翘[7]、桔梗[8]、天山雪莲[9]、枸杞[10]等，而关于染色体加倍后的多倍体药材药效变化的研究较少。本研究选择四倍体金银花为试材，以二倍体金银花为对照，对四倍体金银花的体外抗菌作用和抗病毒作用进行了评价，研究结果为四倍体金银花的临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 药材

以四倍体金银花“九丰一号”品种为试验材料，二倍体金银花“大毛花”品种为对照，两个品种均在山东省平邑县九间棚农业科技园有限公司金银花基地种植，栽培管理相同，同期分别采集两个品种的第一茬二白期鲜花蕾，两者均采用滚筒杀青烘干加工方法干燥[3]，样品由北京中医药大学李卫东副研究员鉴定，均为忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾。

1.2 菌毒株

金黄色葡萄球菌(26076)、乙型链球菌(32204)、大肠杆菌(44103)、绿脓杆菌(ATCC27853)、白色念球菌(CMCC(F)98001)(北京中医药大学基础医学院中医药抗病毒实验室)；肺炎克雷伯菌(46108)(中国食品药品检定研究院)；流感病毒H1N1型(北京中医药大学基础医学院中医药抗病毒实验室)；狗肾传代细胞(MDCK)(北京中医药大学基础医学院中医药抗病毒实验室传代培养并保存备用)；鸡胚(SPF级，北京维里亚维通公司)。

1.3 药品与试剂

琼脂营养培养基、沙氏培养基以及血琼脂培养基、胎牛血清(北京中医药大学免疫学重点实验室)；利巴韦林注射液(山东新华制药股份有限公司，批号：0909017，100 mg·mL-1)；DMEM培养基，胎牛血清2%；pH 7.4的磷酸盐缓冲液；0.25%胰蛋白酶-EDTA(Solarbio公司)。

1.4 仪器

恒温恒湿培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；万分之一天平(Sartorius analytic)；超净工作台(苏州智净净化设备有限公司)；高压灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；细胞用培养瓶和96孔板(Sigma)；CO2恒温培养箱(北京北方华粤贸易有限公司)；倒置显微镜(COIC)。

2 方法

2.1 样品制备

取四倍体金银花药材25 g，精密称定，加12倍量蒸馏水浸泡40 min，煮沸30 min，煎液过滤(4层医用纱布)，药渣继续加8倍量蒸馏水煎煮30 min，煎液过滤，合并两次的滤液，煎液减压浓缩至每100 mL相当于原生药50 g，经高压灭菌后置于冰箱4 ℃备用。对照药材二倍体金银花溶液制备方法与样品药材溶液的制备方法相同制得。体外抗菌和体外抗病毒用同一浓度样品制备液。

2.2 体外抗菌实验

2.2.1 菌液的制备 供试菌种经传代纯培养后，从培养基上挑出受试菌株的菌落，分别取接种环接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌的新鲜培养物至琼脂培养基上，乙型链球菌至血琼脂培养基，白色念球菌至沙氏培养基上，37 ℃恒温培养24 h。采用比浊法将各待测菌用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度为105CFU·mL-1的菌悬液备用。

2.2.2 最低抑菌浓度(MIC)的测定 将配制好的菌液吸取1 mL滴入到无菌的24孔板中，然后将四倍体金银花提取物500 mg·mL-1用移液枪吸取1 mL滴入到24孔板中第一孔与菌液均匀混合。以第一孔的浓度250 mg·mL-1为起始浓度采用对倍稀释法稀释成各种浓度[11]，仅留一孔加培养基和菌液作为对照。同样在另一块板中加入菌液和二倍体金银花水提物，同样做对倍浓度稀释。试验完毕后置37 ℃培养箱中培养24 h。拿出来在黑色背景下观察，有细菌生长呈现浑浊，没有出现浑浊则为无菌生长，即为水提物的MIC。

2.2.3最小杀菌浓度(MBC)的测定 取2.2.2观察的四倍体和二倍体金银花的MIC阴性管中的培养液转种于平板培养基中，于37 ℃培养箱中培养24 h取出，观察是否有细菌生长，无菌生长的最低浓度即为四倍体和二倍体金银花水提物的MBC。

2.3 体外抗病毒实验

2.3.1 水提物对细胞的毒性实验 将四倍体和二倍体水提物分别用维持液按倍比法系列稀释成250、125、62.5、31.25 mg·mL-1……共12个浓度，分别接种到已长成单层MDCK细胞的96孔培养板中，0.1 mL/孔，每个浓度纵向重复4孔，同时设置4孔细胞对照和利巴韦林阳性对照，置于37 ℃，5 % CO2孵箱中培养48 h，每日于倒置显微镜下观察细胞病变情况，以无明显细胞病变(CPE)的最低稀释浓度为药物最大无毒浓度(TC0)，按Reed-Muench法计算半数中毒浓度(TC50)[12]。

2.3.2 水提物对病毒致细胞病变作用的影响 在96孔细胞培养板的MDCK细胞上加入100 TCID50的甲型流感病毒FM1液，100 μL/孔，置于37 ℃，5% CO2孵箱中孵育1h后弃去含有病毒的维持液，将四倍体和二倍体金银花水提物从最大无毒浓度开始用维持液对倍稀释4个浓度，加入到病毒感染的细胞中，每孔200 μL，纵向重复4孔，同时设置利巴韦林阳性对照组、细胞对照组和病毒对照组，将各组置于37 ℃，5% CO2孵箱中培养，逐日倒置显微镜下观察CPE情况，当病毒对照组细胞病变为++++时记录实验结果，细胞病变等级表示为：0%～25%(+)，25%～50%(++)，50%～75%(+++)，75%～100%(++++)。

3 结果

3.1 MIC和MBC测定结果

不同浓度的四倍体和二倍体金银花水提物对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、绿脓杆菌以及白色念珠菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度见表1。

3.2 体外抗病毒实验结果

3.2.1 水提物对细胞的毒性测定 加入药液的MDCK细胞48 h后于倒置显微镜下观察细胞形态，阴性对照组的正常细胞是贴壁生长的上皮样细胞，细胞呈梭形，细胞轮廓清晰，药物毒性致细胞病变的使MDCK细胞变圆、聚集、坏死、脱落，排列不规则(图1)。四倍体和二倍体金银花水提物细胞毒性试验CPE观察结果见表2。结果显示，四倍体金银花水提物TC0为0.244 mg生药·mL-1，TC50为1.665 mg生药·mL-1；二倍体金银花水提物TC0为0.488 mg生药·mL-1，TC50为2.718 mg生药·mL-1；利巴韦林TC0为0.391 mg·mL-1，TC50为2.663 mg生药·mL-1。

表2 四倍体和二倍体金银花水提物对MDCK细胞的毒性实验结果

注：CPE列的每一个数字代表每一孔细胞病变等级，“-”代表无细胞病变。

3.2.2 水提物对流感病毒致细胞病变抑制作用 在显微镜下观察四倍体和二倍体水提物对甲型流感病毒FM1的CPE结果(图1)，四倍体和二倍体金银花水提物抗流感病毒作用的观察结果见表3。结果显示，与病毒对照组比较，四倍体和二倍体金银花水提物对流感病毒致细胞病变显示出一定的抑制作用。四倍体金银花水提物在质量浓度为0.030 5 mg生药·mL-1(1∶16 384)时对流感病毒致MDCK细胞病变有一定的抑制作用。而二倍体金银花水提物在质量浓度为0.488 mg生药·mL-1(1∶1024)、0.244 mg生药·mL-1(1∶2048)时对流感病毒致MDCK细胞病变有一定的抑制作用。

注：A.病毒阳性对照组；B.MDCK细胞对照组；C.0.030 5mg·mL-1的四倍体金银花组；D.0.244 0 mg·mL-1的二倍体金银花组。图1 金银花四倍体和二倍体水提物抑制甲型流感病毒FM1致细胞病变显微图(×40)

4 讨论

染色体加倍后的多倍体药材，如丹参[13]、菘蓝[14]以及蒲公英[15]等，研究报道都具有一定药效作用，但是四倍体金银花的抗菌、抗病毒以及其他相关药效作用还未见报道。本文体外抗菌实验测定结果表明，四倍体和二倍体金银花对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、绿脓

表3 金银花四倍体和二倍体水提物对甲型流感病毒FM1致细胞病变的影响

注：CPE列的每一个数字代表每一孔细胞病变等级，“-”代表无细胞病变。

杆菌、白色念球菌均有不同程度抑菌或杀菌作用，抗菌谱比较广泛，涉及了革兰阳性菌、革兰阴性菌以及真菌。在革兰阳性菌中，四倍体金银花对乙型链球菌抑菌强度高于二倍体金银花，对肺炎克雷伯菌的杀菌强度高于二倍体；在革兰阴性菌中，二倍体金银花对大肠杆菌和绿脓杆菌的杀菌强度高于四倍体金银花，尤其对金黄色葡萄球菌比其他菌种表现更为敏感。

体外抗病毒实验结果显示，四倍体金银花的毒性比二倍体金银花要高一些，与甲型流感病毒FM1对照组相比较，四倍体金银花在低质量浓度0.030 5 mg生药·mL-1(1∶16 384)时对流感病毒致MDCK细胞病变有一定抑制作用，而在无毒浓度以下的较高浓度下细胞CPE相对较为严重，这一结果可能是因为金银花的水提物对细胞具有一定的保全作用，中药和病毒液以及细胞达到一个较为和谐的共存环境，四倍体金银花和二倍体金银花对甲型流感病毒FM1株都有一定的抑制作用，但抑制作用并不是很显著，这可能与中药的提取方式以及有效物质成分基础有关，尚有待深入探讨研究。四倍体金银花的抗菌、抗病毒作用得到了初步的验证，这将为其进一步的药效研究提供一定的药理依据。

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ExperimentalStudyonAntimicrobialandAntiviralActivitiesofTetraploidLoniceraeJaponicaeFlosinvitro

HUXuan1，LIWeidong2，3*，JIALing4*，ZHANGShuofeng2，WUJun4，QIUZeji4，ZENGYumin4

(1.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCroPGeneResourcesandGermplasmEnhancementinSouthernChina，Danzhou571737，China； 2.SchoolofChineseMateriaMedica，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China； 3.EngineeringResearchCenterofGoodAgriculturalPracticeforChineseCrudeDrugsofEducationMinistry，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China； 4.SchoolofBasicMedicalSciences，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China)

Objective：To study the antimicrobial and antiviral activities of the tetraploid Lonicerae Japonicae Flosinvitro.Methods：Compared with the diploid Lonicerae Japonicae Flos，the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) were used to evaluate the antimicrobial effects of the aqueous extract of the tetraploid Lonicerae Japonicae Flos againstStaphylococcusaureus，Betahemolyticstreptococcus，Escherichiacoli，Pseudomonasaeruginosa，CandidaalbicansandKlebsiellapneumonia.The maximum non-toxic concentration (TC0) and median toxic concentration (TC50) of the aqueous extract of the tetraploid on Madin-Dar by Canine Kidney (MDCK) cell were detected by cytopathic effect (CPE).Adding 100TCID50of influenza A virus FM1 into cell microtiter plates，then getting rid of the all the virus solutions after adsorbed in the plates for 1 hour，adding the maximal non-toxic concentration dilution.The influences of the aqueous extract on the CPE of FM1 were observed by using CPE method.Results：The aqueous extract of the tetraploid Lonicerae Japonicae Flos had inhibitory effect and bactericidal action againstS.aureus，B.streptococcus，E.coli，P.aeruginosa，C.albicansandK.pneumonia.It had strong inhibitory effect and bactericidal action againstS.aureusamong the six strains.The aqueous extract of the tetraploid had stronger inhibitory effect againstB.streptococcusand stronger bactericidal action againstK.pneumoniathan that of the diploid.The aqueous extract from the tetraploid showed inhibitory effect on the CPE induced by FM1when the concentration of the aqueous extract was 0.0305 mg·mL-1.While its reference herb，the diploid Lonicerae Japonicae Flos，showed inhibitory effect on the CPE when the concentration of the aqueous extract was 0.488 0 and 0.244 0 mg·mL-1.Conclusion：The tetraploid Lonicerae Japonicae Flos had the antimicrobial and antibacterial activityinvitro.

Tetraploid Lonicerae Japonicae Flos；antibacterial activity；influenza A virus FM1；antiviral activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.011

2015-03-09)

国家自然科学基金(31370360)

*

李卫东，研究员，研究方向：道地药材资源评价与品种创新，E-mail：liweidong2005@126.com； 贾翎，讲师，研究方向：抗感染与免疫调节，E-mail：stella01157@sina.com