中药材DNA条形码鉴定研究进展△

辛天怡，雷美艳，宋经元,*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.重庆市药物种植研究所，重庆 408435)

·综述·

中药材DNA条形码鉴定研究进展△

辛天怡1，雷美艳2，宋经元1,2*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.重庆市药物种植研究所，重庆 408435)

DNA条形码技术给中药鉴定学发展带来新的机遇，中药材DNA条形码鉴定数据库及中草药DNA条形码生物鉴定体系的创建有利于推进中药鉴定标准化和国际化。中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则已纳入《中华人民共和国药典》2010版第三增补本，为中药材基原物种鉴定提供强有力的科技支撑，将在中药材及中成药流通监管、道地药材鉴别、保健食品和食品质量安全控制等领域发挥重要作用。将中药材DNA条形码分子鉴定法与中国药典规定的其他鉴别方法相结合，能够对药品质量进行综合评价与有效监控。

中药材；DNA条形码；鉴定；ITS2；psbA-trnH；COI

自2003年Paul Hebert首次提出“DNA条形码”概念[1]，至今已逾10年。DNA条形码分子鉴定技术走过了从无到有再到飞速发展的历程。Miller称DNA条形码技术推动了分类学的“文艺复兴”[2]，能够给日渐萎缩的传统形态分类学带来新的发展机遇。如今，DNA条形码技术已广泛应用于不同行业，针对不同研究对象和内容，均有相关研究项目和工作组对中药鉴定学、系统分类学、发育进化、生态学、生物多样性保护等各个领域展开研究[3]。研究者认为该技术能够有效监控珍稀濒危物种进出口贸易，在中药材流通领域及食品药品监督管理等方面发挥巨大作用[4]。由于传统鉴定方法在中药材物种鉴定上存在局限性，为保证中药材临床用药的安全、有效性，有必要采用新技术新方法对其进行补充，中药材DNA条形码分子鉴定法[5-6]为中药材基原物种的鉴定提供了强有力的科技支撑。本文对DNA条形码技术在中药材鉴定及相关领域的研究进展进行综述，并对该技术的应用前景进行展望。

1 中药材DNA条形码分子鉴定研究进展

为解决中药行业对中药材基原物种鉴定的需求，Chen等[7]基于大量实验样本在国际上首先验证并确立ITS2序列作为药用植物通用条形码，并在川芎、蛇床、麦冬等药材基原物种及其混伪品的鉴定工作中得到良好应用[8-10]。基于DNA条形码技术在药用植物物种鉴定等的成功应用，研究者将该技术应用范围逐步扩大到中药材。2014年Biotechnology Advances文章[11]以“DNA条形码鉴定是草药鉴定从形态到DNA的文艺复兴”介绍了该团队创建的中药材DNA条形码鉴定体系和数据库，该数据库涵盖中国、日本、韩国、印度、美国和欧洲药典中记载的绝大部分药材的DNA条形码序列，对推进中药鉴定方法通用化、标准化和国际化具有重要作用。

1.1 中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则的确立

陈士林等[6]基于大样本量实验创建以ITS2序列为主要条形码的中药材DNA条形码分子鉴定体系，并提出中药材DNA条形码分子鉴定指导原则，其中植物类中药材选用ITS2为主体序列，psbA-trnH为辅助序列；动物类中药材采用COI为主体序列，ITS2为辅助序列，符合中药材鉴定简单、精确的特点，有明确的判断标准，能够实现对中药材及其基原物种的准确鉴定。目前该指导原则已纳入《中华人民共和国药典》(2010版 第三增补本)[12]，主要用于规范中药材DNA条形码分子鉴定法，为其应用提供指导，适用于中药材(包括药材、药材粉末及部分药材饮片)及其基原物种的鉴定，其流程如图1所示。

图1 中药材DNA条形码分子鉴定流程

1.2 中药材DNA条形码分子鉴定法应用实例

2012年，辛天怡等[13]采用DNA条形码分子鉴定技术对羌活药材及其混伪品进行研究，证实ITS/ITS2序列能够稳定、准确区分羌活药材及其混伪品，该研究为后续工作提供了新的思路。Hou等[14]对山茱萸的研究表明，DNA条形码分子鉴定法能够用于新鲜或自然干燥样本的鉴定，而市售山茱萸药材多采用文火烘或置沸水中略烫以去除果核，再行干燥，如此处理方法使得市售山茱萸药材DNA降解严重，无法获得满足后续实验的基因组DNA，故DNA条形码分子鉴定法不适用于市售山茱萸药材的鉴定。该研究提示DNA条形码分子鉴定法必须要在适宜范围内应用，对于已经过炮制加工(简单切制、低温干燥等除外)的饮片，此方法具有局限性。研究者已对中国药典收载中药材进行实验研究(表1列举部分案例)，证实该方法的实用性价值，扩充和完善中药材DNA条形码数据库，并将其逐渐应用于实际鉴定工作当中[15]。该方法能够在中药生产企业原料监管、医院药房中药材饮片真伪鉴定、中药材流通领域、出入境检验检疫、海关中药材进出口管理与鉴定等方面发挥重要作用。

表1 中药材DNA条形码分子鉴定研究实例

2 DNA条形码分子鉴定技术在中药及相关领域的应用前景

2.1 中成药DNA条形码分子鉴定

近年来中药作为西药的补充或替代在亚洲之外的应用与日俱增[72]。中药制品的日益普及使得该行业产值每年增加数百万美元[73]，与此同时全球补充和替代药物的使用也在增加。中医处方通常包含不同动植物来源药材，协同作用、相互影响以达到预期治疗效果。方剂中不同药材加工炮制方法的特殊性，所含成分的生物来源难以确定，均会导致有关中药质量、疗效和安全性等方面的问题[74]。Newmaster等[75]对于北美12家公司44种草药产品的检测结果显示大部分草药产品均能够获得DNA条形码序列(rbcL+ITS2序列)。59%的供试样本中含有未在标签上列出的物种；68.2%的供试样本中存在替代品；实验中涉及到的草药产品多数质量较差，含有大量替代品、杂质或其他无药用价值的填料；仅有2家公司的产品未检出任何替代品。该研究表明DNA条形码技术能够用于北美草药产品市场监控，有助于监督制药企业为消费者提供安全、优质的草药产品。

目前基于DNA条形码技术对中成药进行鉴定的相关报道较少，但已有研究者采用DNA分子鉴定技术对中成药进行鉴定。Cheng等[76]基于高通量测序技术和宏基因组数据分析等方法，对中成药六味地黄丸物种组成进行分析，结果显示不同厂商生产的六味地黄丸物种组成上差异较大，影响其临床疗效。Coghlan等[77]基于高通量测序技术检测包括散剂、片剂、胶囊剂、胆片和草药茶等在内的15种不同剂型的中成药，共获得超过49 000条trnL和16S rRNA序列，证实第二代高通量测序技术(high-throughput sequencing，HTS)是在基因层面检测复方中药的有效方法。部分供试样本中含有濒危野生动植物物种国际贸易公约(CITES)中所收载的物种、潜在毒性/致敏性植物或未申明成分。序列比对结果显示植物药中含有68个不同科属的植物，包括麻黄属(Ephedra)、细辛属(Asarum)等具有潜在毒性的属种；动物药中包含一些渐危、濒危甚至极度濒危的种属，如亚洲黑熊(Ursusthibetanus)、赛加羚羊(Saigatatarica)。此外，许多供试品中检测出含有一些极少在产品包装上标识的牛科(Bovidae)、鹿科(Cervidae)和蟾蜍科(Bufonidae)动物的DNA。该研究表明采用高通量测序技术进行深度测序是检测中成药的有效手段，植物DNA相关数据库的完善将有助于监测中成药的合法性和安全性。崔占虎等[78]基于psbA-trnH和rbcL序列，通过克隆技术对连翘败毒丸中原料药材进行分子鉴别，结果显示psbA-trnH序列能够鉴定出连翘败毒丸19种原料药材中的9种，rbcL序列能够鉴定出其中6种，二者一共能够鉴定出10种药材。由此可见，DNA条形码技术在中成药鉴定工作中运用尚不广泛，需要加强此方面的研究。

2.2 保健食品DNA条形码分子鉴定

DNA条形码分子鉴定技术除了发挥其在药用植物及中药材物种鉴定领域的优势之外，亦可尝试将其应用于保健食品鉴定工作中。食品质量安全一直是消费者及食品安全监督管理机构关注的重点，无论何种情况，食品质量问题一旦被媒体报道出来，都会对舆论造成很大影响。为保证食品质量，各国政府均依据本国实际情况制定有关食品生产及保藏的国家标准[79]。保健食品作为特殊食品，其质量安全同样极受关注。我国《保健食品注册管理办法(试行)》由国家食品药品监督管理总局颁布[80]，于2005年7月1日正式实施，该办法对保健食品进行严格定义如下：保健食品指声称具有特定保健功能或者以补充维生素、矿物质为目的的食品。即适宜于特定人群食用，具有调节机体功能，不以治疗疾病为目的，并且对人体不产生任何急性、亚急性或者慢性危害的食品。依据国家食品药品监督管理总局规定，列入既是食品又是药品的物品名单的中药材共84种[81]，可用于保健食品的共114种[82]，保健食品禁用物品共59种[83]。为保证保健食品质量安全可靠，确保其不含有禁用物品列表中的物种，有必要对其原材料物种来源进行监控。

目前食品监控多采用蛋白质或DNA序列分析方法，基于蛋白质的分析方法主要包括免疫组化分析、高效液相色谱(HPLC)和薄层色谱(TLC)等[84，85]。然而上述方法仅适用于新鲜食品，对于已经过深加工的食品，其效率较低；相较而言，基于DNA序列的鉴定方法更为适用，DNA序列提供的有效信息比蛋白质丰富，且易于提取，即使供试样品量较少也能够获得满足后续分析的基因组DNA，适用于不同类型食物，因此可选用基于DNA序列的方法对深加工食品进行鉴定[86-88]。随着分子生物学技术迅速发展，DNA分子标记已逐渐用于追踪食品生产工业流水线上的原材料[88-90]。研究者正在尝试将DNA条形码分子鉴定技术应用于保健食品原材料及深加工制品物种鉴定方面，实现其在保健食品原料质量控制方面的作用，以保证食品质量安全并有效防止商业欺诈现象。De Mattia等[91]采用CBOL提出的核心条形码序列matK+rbcL及trnH-psbA间隔序列对唇形科(Lamiaceae)薄荷属(Mentha)、罗勒属(Ocimum)、牛至属(Origanum)、鼠尾草属(Salvia)、百里香属(Thymus)和迷迭香属(Rosmarinus)植物进行鉴定。结果显示除牛至属墨角兰(OriganummajoranaL)和牛至(OvulgareL)两个物种由于杂交事件使得种内变异均高于其种间变异之外，大部分样本都能够鉴定到物种；matK和trnH-psbA序列能够有效区分市售正品罗勒(OcimumbasilicumL)及其同属植物。Xin等[29]对“药食同源”的枸杞子进行鉴定分析，结果表明ITS2序列能够区分宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)、枸杞(Lchinense)和黑果枸杞(Lruthenicum)三个物种，可以作为枸杞子及其近缘物种鉴定的DNA条形码。

2.3 DNA条形码分子鉴定的其他应用

中药材生态型多样性是道地药材研究的重要组成部分，黄林芳等[92]对产自新疆及内蒙古两大生态适宜生产集中区(两类生态型)野生肉苁蓉(CistanchedeserticolaYC Ma)的psbA-trnH序列分析结果表明，不同产地肉苁蓉psbA-trnH序列存在变异位点，序列比对后新疆、内蒙古产肉苁蓉在191 bp处存在G-A变异，该序列可以区分野生肉苁蓉生态型。由于植物不同的栽培品种基因遗传变异较小，且往往存在杂交繁育事件，采用通用DNA条形码序列进行药用植物栽培品种水平的鉴定存在局限性。Kane和Cronk提出基于整个叶绿体基因组和大部分核基因组的“超级条形码(ultra-barcoding)”方法[93]，与传统DNA条形码技术仅需要相对较短的通用DNA序列相反，该方法将叶绿体全基因组与部分核基因组相结合，为证明物种水平以下的遗传多样性提供充足的信息，能够区分纯系和杂交品系，因此该方法比传统DNA条形码技术灵敏度更高。Li等[94]提出利用单分子测序技术的环状一致测序策略的叶绿体基因组测序与SNP检测流程，该方法具有迅捷的拼接效率和对SNP的高精度检测能力，在基于叶绿体基因组序列的进化生物学和基因组学研究方面有着巨大的应用前景，也是推进药用植物超级条形码研究的有力工具。Kane等[95]采用超级条形码对可可(TheobromacacaoL)进行鉴定，发现可可叶绿体基因和核基因中存在单核苷酸多态性(SNP)，有利于鉴别不同栽培品种。该研究为中药“道地药材”品种及鉴定提供了新思路。

除上述应用领域之外，亦有研究者将DNA条形码技术应用于食用菌鉴定中。李艳春等[96]对于云南食用牛肝菌的研究表明，被云南当地人认为的4“种”牛肝菌经鉴定为12个独立物种，该研究筛选出rpbl序列作为牛肝菌属(Boletus)的核心条形码，tefl-α和rpb2可作为辅助条形码用于该属真菌的鉴定。Avin等[97]基于ITS序列对侧耳科(Pleurotaceae，平菇Pleurotusostreatus、杏鲍菇Peryngii)、膨瑚菌科(Physalacriaceae，金针菇Flammulinavelutipes)和小皮伞科(Marasmiaceae，香菇Lentinulaedodes)中的常见食用菌进行鉴定，证实ITS序列能够作为担子菌分类鉴定的核心DNA条形码。在此基础之上Avin等[98]基于IGS1和ITS序列相结合对栽培平菇(来源于侧耳属Pleurotus)的遗传变异情况和物种界定进行分析。

3 展望及挑战

随着十余年的发展，DNA条形码技术已逐渐走向成熟，该技术已由科研人员的理论及实验研究层面逐步转变为面向市场、面向企业、面向食品药品监督管理部门等的实际应用方面的研究。该技术为缓解食药监管、濒危物种监管及海关进出口检验检疫部门，医药企业，农业和畜牧业等不同行业缺乏传统分类学人才的现状奠定基础。将DNA条形码分子鉴定法应用于中药材鉴定，无疑是对传统药材鉴定方法的一个巨大补充。构建中药材DNA条形码分子鉴定数据库，有利于对中药材的准确快速鉴定，可满足不同行业人员对中药材鉴定的需求，对保证临床用药安全提供坚实基础。

物种鉴定能够确保药品的“真伪”，而有效成分或有效部位含量测定则可确保药品的“优劣”，二者均是药品质量控制工作中不可或缺的步骤。虽然DNA条形码技术具有广泛的应用前景，但在研究过程中亦会遇到各种挑战，该技术并不能完全替代其他现有鉴别技术手段，如显微、理化、色谱和光谱等对中药材、饮片及中成药进行物种鉴定和质量控制。不同入药部位的中药材根据其组织结构特征不同，药材在采收时所含生活细胞的量均具有差异，某些特定部位，如根皮等其外部多具有木栓组织，其中的木栓细胞为死细胞，DNA降解程度较高，会对实验产生一定影响，在操作时应当尽量去除此类组织。此外，储存时间较久、贮藏养护方式不当造成中药材、饮片和中成药生虫、变色、走油或霉变等现象，会严重影响其质量和疗效，此类情况在进行DNA条形码鉴定过程中，可能会由于DNA降解过于严重而无法成功获得其条形码序列，亦或由于霉变使得提取到的药材DNA被真菌污染从而影响鉴定结果。因此，在实际药检工作中如若遇到上述情况，须将DNA条形码技术与其他方法相结合进行检验，综合评价药品质量。

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DNA Barcoding of Traditional Chinese Medicine

XIN Tianyi1，LEI Meiyan2，SONG Jingyuan1,2*

(1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；2.Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation，Chongqing 408435，China)

DNA barcoding provides a new opportunity to the development of Authentication of Chinese Materia Medica.The establishment of the DNA barcoding system for herbal materials and the online DNA barcoding database are accelerating the standardization and internationalization of the authentication methods of Chinese Materia Medica.The guiding principles for molecular identification of traditional Chinese medicine using DNA barcoding technology have been documented in the enlarged edition III of Chinese Pharmacopoeia(2010 edition).These principles strongly support the identification of the traditional Chinese medicine.It will play an important role in the market circulation and supervision of traditional Chinese medicine and patent Chinese medicine，identification of genuine medicinal materials，and quality control of functional food and other food in the future.The combination of DNA barcoding and other identification techniques recorded in Chinese Pharmacopoeia can perform the comprehensive evaluation and effective supervision to the drug quality.

herbal materials；DNA barcoding；identification；ITS2；psbA-trnH；COI

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.020

2014-01-09)

国家自然科学基金资助项目(81373922)

*

宋经元，Tel：(010)57833199，E-mail：jysong@implad.ac.cn