苏铁叶黄酮类化合物的检测与提取工艺研究△

史红艳，朱海萍，杨培君

(陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001)

·基础研究·

苏铁叶黄酮类化合物的检测与提取工艺研究△

史红艳，朱海萍，杨培君*

(陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001)

目的：以苏铁叶为研究材料，开展黄酮类化合物的检测，同时对其提取工艺进行优化。方法：以UV法检测的苏铁叶总黄酮得率为评价指标，在单因素试验的基础上，采用L9(34)正交试验，优化提取工艺条件。结果：定性检测显示，苏铁叶中含黄酮、二氢黄酮等黄酮类化合物组分。研究结果表明，最佳工艺参数：提取温度为80 ℃，乙醇浓度为70%，料液比为1∶25，提取时间为1.5 h。在此条件下总黄酮的平均得率为1.67%。结论：该工艺合理，重复性好，能有效提高苏铁叶总黄酮得率。

苏铁叶；总黄酮；检测；工艺优化

苏铁叶为苏铁科苏铁属植物苏铁CycasrevolutaThunb.的叶，又名铁树叶[1]、凤尾蕉叶[2]。甘、淡，平，小毒。入肝、胃经，有理气、活血功能[2]。相关研究报道[4-6]，苏铁叶中药复方制剂经煎煮后对小鼠肿瘤生长有抑制作用[3]，可治疗胃癌、肺癌、肝癌等。据调查，陕南民间有铁树叶治结肠炎等疾病的用法。

相关研究报道[7-11]，黄酮类化合物具有多种生理活性，如抗氧化、抗炎抑菌、抗病毒、抗糖尿病、抗抑郁、延缓衰老、增强心血管功能、保护神经系统、改善记忆力以及增强免疫力等。对苏铁研究报道较少，潘韬文报道了苏铁种皮[12]；刘世彪报道了苏铁种子的化学成分及毒性[13]；熊江等[14]从贵州苏铁叶中分离出8种化合物；杨秋利[15]对苏铁中的微量元素进行了测定；此外，有关苏铁分类学[16]、解剖学[17]、分子生物学[18-19]方面以及提取物病理学研究[4，20]也有报道，但苏铁叶中黄酮类化合物的系统研究尚未见报道。本研究以苏铁叶为供试材料，通过乙醇水溶液热回流提取法，开展苏铁叶总黄酮化合物的检测及提取工艺条件的优化，以期为苏铁叶黄酮类化合物的研究与利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

苏铁叶于2012年9月采集于陕西汉中市栽培植株，烘干后粉碎，过粒径为0.45 mm的筛，备用。

1.2 试剂与仪器

亚销酸钠(NaNO2)、氯化铝(AlCl3)、氢氧化钠(NaOH)、95%乙醇、无水乙醇、乙醚等均为分析纯；芦丁标准品(中国食品药品检定研究院，批号：100080-200707)。

紫外可见分光光度计(UV-2550，日本岛津)；电子天平(梅特勒AL204，精密度0.000 1 g)；旋转蒸发仪(RV10，德国IKA公司)；优普超纯水机(UPH-Ⅱ，成都超纯科技有限公司)；索氏提取仪。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮的提取 考虑溶剂的极性、毒性及后续处理的难度，故选取一定浓度的乙醇作为提取溶剂，提取流程为苏铁叶粉末→乙醚去脂→乙醇热回流→抽滤→定容→黄酮类化合物溶液。

1.3.2 总黄酮的定性测定 分别用盐酸-镁粉、盐酸-锌粉、硼氢化钠(NaBH4)、AlCl3等8种显色剂做显色反应，对苏铁叶黄酮类化合物进行定性检测。

1.3.3 UV法检测设计与总黄酮的定量测定 取一定量的芦丁标准品和样品溶液，经NaNO2-AlCl3显色后，用UV-2550紫外可见分光光度计于400～600 nm波长扫描，以确定扫描波长。

精密称取120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品6.0 mg，用60%乙醇水溶液溶解并定容于50 mL容量瓶，摇匀，即得芦丁标准溶液。精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入浓度为0.5 mol·L-1的NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；然后加入浓度为0.3 mol·L-1的AlCl3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；再加入浓度为1.0 mol·L-1NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇稀释至10.0 mL，配成系列标准溶液，放置15 min后，在确定的波长处测定吸光度，以吸光度对质量浓度作标准曲线。

吸取2.0 mL样品提取液于10 mL容量瓶中，按上述芦丁标准曲线绘制方法配制溶液，以试剂空白为参比液，测其吸光度记为A，代入标准曲线得提取液浓度C(μg·mL-1)。按以下公式计算苏铁叶中总黄酮得率X(%)：

C为样品溶液中黄酮类化合物的浓度(μg·mL-1)；V为供试样品的体积(mL)；w为称取样品重量(μg)；b为供试液稀释倍数。

1.3.4 单因素试验 准确称取脱脂后的苏铁叶粉末3份，每份1.0 g，置于三角瓶中，根据各提取因素，采用不同的单因素3水平试验进行热回流提取。抽滤后得乙醇提取液，滤渣重复提取2次，趁热抽滤，合并滤液，并定容至100 mL。按标准曲线建立的方法测定吸光度，并计算总黄酮类化合物的得率。

1.3.5 正交试验设计 考虑各因素之间的相互影响，试验以苏铁叶中总黄酮得率为衡量指标。分别选取提取温度、料液比、乙醇浓度和提取时间4因素及其对应的3个较优水平，进行L9(34)正交试验，确定提取总黄酮的最佳工艺条件，正交试验设计见表1。

表1 因素水平表

1.3.6 方法验证 重复性试验：准确称取苏铁叶粉末6份各1.0 g，按确定的工艺制备样品溶液。以标准曲线的建立方法测定吸光度，计算苏铁叶黄酮类化合物含量。

回收率试验：准确吸取3份已知质量浓度的供试样品溶液1.0 mL于试管中，分别加入0.5、1.5、2.5 mL的芦丁标准液(质量浓度为0.11 mg·mL-1)，按标准曲线的建立方法测定3组加标样品的吸光度值，每组加标样品平行测定3次，计算平均值。回收率公式：回收率(%)=(加标试样测定黄酮量-已知试样黄酮量)/加标量×100%

稳定性试验：移取样品溶液2.0 mL，以标准曲线建立方法测定吸光度，每隔10 min测一次，测程70 min。

精密度试验：移取最佳条件下提取的苏铁叶样品液2.0 mL于10 mL容量瓶中，按标准曲线的建立方法测定吸光度值，平行测定6次。

2 结果与分析

2.1 显色反应结果

黄酮类化合物的定性检测结果表明，苏铁叶中黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、查尔酮等呈阳性反应，见表2。

表2 黄酮类化合物显色反应结果

2.2 波长扫描结果

经波长扫描，芦丁标准溶液和黄酮样品溶液在505 nm处均有吸收峰，且峰形相似，故芦丁可作为对照品用于检测苏铁叶黄酮类化合物。

2.3 标准曲线的绘制

配制系列浓度的芦丁标准溶液，在波长505 nm处测定吸光度，并以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。芦丁对照品溶液，在0～60 μg·mL-1与吸光度线性关系良好，线性回归方程为Y=11.543X+0.0677，r=0.999 6，见图1。

图1 芦丁对照品标准曲线

2.4 提取次数的选择

准确称取1.0 g苏铁叶干粉，在温度为80 ℃，乙醇浓度为60%，料液比为1∶20，提取时间2 h条件下，分别提取黄酮1、 2、3、4次。提取3次时总黄酮的得率相对最大，故选3次为最佳提取次数，见图2。

图2 提取次数对黄酮类化合物得率的影响

2.5 单因素试验结果

2.5.1 提取时间对苏铁叶中总黄酮得率的影响 准确称取1.0 g苏铁叶干粉，固定其他3因素，比较提取时间对总黄酮得率的影响，重复提取3次，合并滤液。提取时间在2 h内，总黄酮得率随时间增加而增加；2～2.5 h其得率基本不变，之后得率反而下降。综合考虑，选取2 h为最佳提取时间，见图3。

图3 提取时间对黄酮类化合物得率的影响

2.5.2 料液比对苏铁叶中总黄酮得率的影响 准确称取1.0 g苏铁叶干粉，固定其他条件，分别提取2 h，比较不同料液比对总黄酮得率的影响。随料液比降低，苏铁叶总黄酮得率逐渐增加；但当料液比为1∶20时，总黄酮得率达到最大值；继续降低料液比，其得率反而下降。故选取1∶20为最佳料液比，见图4。

图4 料液比对黄酮类化合物得率的影响

2.5.3 提取温度对苏铁叶中总黄酮得率的影响 准确称取1.0 g苏铁叶干粉，在前2个最优单因素条件下，固定其他条件，比较不同温度对总黄酮得率的影响。随提取温度的升高，黄酮类化合物的得率增加；当达80 ℃以上，得率增加不明显；继续升高温度得率降低。故选取80 ℃为最佳提取温度，见图5。

图5 温度对黄酮类化合物得率的影响

2.5.4 乙醇浓度对苏铁叶中总黄酮得率的影响 准确称取1.0 g苏铁叶干粉，选择以上3个最优单因素，比较不同浓度乙醇对总黄酮得率的影响。当乙醇浓度达70%时，总黄酮得率获最大值；再增大乙醇浓度，总黄酮得率反而降低。故选70%为最佳乙醇浓度，见图6。

图6 乙醇浓度对黄酮类化合物得率的影响

2.6 正交试验结果

在单因素试验的基础上，选择L9(34)正交表，对提取温度、乙醇浓度、提取时间和料液比4因素进行正交试验，确定最佳提取条件，试验结果见表3、方差分析见表4。

4因素中提取温度对总黄酮得率影响最大，各因子对总黄酮得率的影响主次顺序依次为提取温度(A)>提取时间(C)>料液比(D)>乙醇浓度(B)。分析正交试验结果，确定工艺条件为A3B2C1D3。结合单因素试验结果，综合考虑成本和以上因素，最终确定苏铁叶总黄酮的最佳工艺优化条件为A2B2C1D3。即：提取温度为80 ℃，乙醇浓度为70%，提取时间为1.5 h，料液比为1∶25。

表3 正交试验结果

注：A1.提取温度为70 ℃；A2.提取温度为80 ℃；A3.提取温度为90 ℃；B1.乙醇浓度为60%；B2.乙醇浓度为70%；B3.乙醇浓度为80%；C1.提取时间为1.5 h；C2.提取时间为2.0 h；C3.提取时间为2.5 h；D1.料液比为1∶15；D2.料液比为1∶20；D3.料液比为1∶25。

表4 方差分析结果

2.7 样品的UV法检测结果

在优化的条件下，样品的总黄酮平均得率为1.67%，RSD=2.66%，见表5。

表5 样品的UV法试验结果(n=3)

2.8 方法验证试验结果

重复性试验结果，RSD=2.30%(n=6)，表明其重复性良好。回收率试验结果表明，方法的准确度高，见表6。

稳定性试验结果表明，苏铁叶黄酮类化合物显色后，30 min内吸光度无明显变化；30 min以后，吸光度逐渐降低；建议在30 min内完成试验测定。

精密度试验结果：样品溶液6次测定的平均吸光度值为0.457，RSD值为0.309%，表明仪器的精密度良好。

表6 加样回收率试验结果(n=9)

3 讨论

通过显色反应定性确定苏铁叶中含有黄酮、二氢黄酮等黄酮类化合物，但其组分鉴定还有待进一步研究。在单因素试验的基础上，采用L9(34)正交试验对苏铁叶黄酮类化合物的提取工艺条件进行优化。结果表明，随各单因素的依次优化，最优条件逐步增多，黄酮的得率也随之逐渐增大。优化的苏铁叶总黄酮提取工艺条件：温度为80 ℃，料液比为1∶25，提取时间为1.5 h，乙醇浓度为70%，此条件下苏铁叶的总黄酮得率为1.67%。各因素对苏铁叶总黄酮得率的影响主次顺序依次为提取温度(A)>提取时间(C)>料液比(D)>乙醇浓度(B)。在优化工艺条件下，苏铁叶总黄酮得率较高，重复性好。采用本方法对苏铁叶提取液中总黄酮含量进行定量分析，其工艺及条件可行性和可操作性强，结果可靠。

不同植物材料总黄酮提取工艺有一定的差异，张吉祥等[21]采用微波辅助法提取枣核中的总黄酮，报道各因素对枣核黄酮提取的影响程度大小依次为料液比>提取温度>提取时间>乙醇体积分数>微波功率；赵雪梅等[22]采用二次旋转组合设计的方法，探讨常山胡柚皮中黄酮类化合物的最佳提取工艺参数，指出影响黄酮提取率的参数主次顺序为提取时间>料液比>提取温度=乙醇浓度。比较结果表明，采用不同方法，在不同条件下提取黄酮类化合物，显著性影响因素不同，而其他因素影响差别较小。因此，本试验所得的优化工艺条件合理，可为苏铁叶总黄酮的进一步研究和资源开发利用提供参考依据。

张婧萱等[23]报道，淮山药中总黄酮含量为1.12%；黄红英等[24]测定青蒿中黄酮类化合物的含量为2.885%；旷春桃等[25]研究大叶冬青叶中总黄酮提取工艺，并采用氯化铝法测定黄酮的含量，其总黄酮得率为0.68%；薛淑萍等[26]在优化工艺条件下，测定桑叶中黄酮类化合物含量为0.18%。比较结果表明，苏铁叶中黄酮类化合物含量除低于青蒿外，高于淮山药、大叶冬青叶、桑叶中的含量。因此，苏铁叶作为一种含黄酮类化合物的中草药资源植物，具一定的开发利用潜力。

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Extraction and Determination of Flavonoids from Leaves ofCycasrevoluta

SHI Hongyan，ZHU Haiping，YANG Peijun*

(School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong Shaanxi 723001，China)

Objective：To study the extraction and determination of flavonoids from leaves ofCycasrevoluta.Methods：The total flavonoids was determined by UV.The yield of total flavonoids was used as index，the extraction condition was optimized by single factor test and orthogonal design L9(34).Results：The results showed that the leaves ofC.revolutacontained varied flavonoids，including flavones，dihydrogen flavones etc.The optimal extraction conditions were as the following：temperature of 80 ℃，ethanol concentration of 70%，solid-liquid ratio of 1∶25 and time 1.5 h.With this method，the extraction ratio of total flavonoids was 1.67%.Conclusion：The established method is reasonable，reproducible，and can effectively improve the yield of total flavonoids fromC.revolutaleaves.

Cycasrevolutaleaves；flavonoids；determination；technological optimization

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.009

2014-06-11)

国家中医药公共卫生专项(201207002)；汉中市科技计划发展项目(2012-46-1)

*

杨培君，教授，研究方向：资源植物研究；E-mail：yang@snut.edu.cn