复方坤血停对药物流产模型大鼠凝血功能及性激素水平的影响△

杨梅，冷康，王梦，郑云枫，程建明，陈湘玉,3*

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210029；2.南京市妇幼保健院，江苏 南京 210004；3.南京市鼓楼医院，江苏 南京 210008)

·基础研究·

复方坤血停对药物流产模型大鼠凝血功能及性激素水平的影响△

杨梅1,2，冷康1，王梦1，郑云枫1，程建明1，陈湘玉1,3*

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210029；2.南京市妇幼保健院，江苏 南京 210004；3.南京市鼓楼医院，江苏 南京 210008)

目的：研究复方坤血停对大鼠药物流产后凝血功能的影响，并探讨其作用机制。方法：采用妊娠大鼠灌服米非司酮和米索前列醇造成不完全流产模型，观察复方坤血停对模型大鼠凝血指标及子宫出血量的影响，同时检测血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、血栓素(TXB2)和6-酮前列腺素(6-Keto-PGF1α)的水平变化。结果：复方坤血停可明显减少子宫出血量，缩短药物流产模型大鼠血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)，血清TXB2、E2水平较模型组升高(P<0.05，P<0.01)。结论：复方坤血停可明显降低流产模型大鼠子宫出血，其机制可能与其降低凝血因子水平及调节体内激素水平有关。

坤血停；药物流产；子宫出血；凝血功能；激素水平

药物流产后子宫出血不止，属于中医“小产”和“产后恶露不行”的范畴[1]。中医认为流产后耗伤天癸，以致气血虚亏，冲任不固，瘀血阻络，瘀热阻胞等，因此治疗应虚实兼顾，祛邪扶正并施。复方坤血停由蒲黄、五灵脂、当归、三七、香附以1∶1∶1∶1∶0.5的配比组成，具有行气止痛、化瘀止血之功能，临床上被用于药物流产后子宫出血，具有较好的疗效。本实验以早孕大鼠药物致流产形成出血为模型[2-3]，观察复方坤血停对大鼠的血浆凝血指标及子宫出血量的影响，同时还检测了血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、血栓素(TXB2)和6-酮前列腺素(6-Keto-PGF1α)的水平变化，对其作用机制进行探讨，为新药的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物

SD大鼠，SPF级，雌性80只，雄性40只，交配受孕数量66只。体重250～300 g。北京维通利华实验动物技术有限公司中心提供，许可证号SCXK(京)2012-0001，合格证号11400700048568。

1.2 药物与试剂

坤血停提取物：取蒲黄、五灵脂、当归、三七和香附，加水提取两次，浓缩至含生药2 g·mL-1的清膏，加乙醇醇沉，过滤，滤液减压回收，浓缩得提取物样品(1克提取物相当于3.2克生药)，置4 ℃冷藏保存，使用前以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制成质量浓度分别为0.2、0.4、0.8 g·mL-1(以生药计，下同)坤血停提取物；宫血宁胶囊(0.13 g/粒，批号：ZLA1305，云南白药集团股份有限公司)以0.5% CMC-Na配制成质量浓度为0.013 g·mL-1的混悬液备用。

米非司酮(25 mg/片，批号为130303，上海新华联制药有限公司)临用前以0.5%CMC-Na配制成质量浓度为0.83 mg·mL-1的混悬液备用；米索前列醇(0.6 mg/片，批号为130603，湖北葛店人福药业有限责任公司)临用前以0.5%CMC-Na配制成质量浓度为0.01 mg·mL-1的混悬液备用。

水合氯醛(批号为20130426，南京寿德试剂有限公司)用氯化钠注射液配制成10%溶液。

凝血酶原时间(PT)测试试剂盒(批号：545548)；活化部分凝血酶时间(APTT)测试试剂盒(批号：547198)；凝血酶时间(TT)测试试剂盒(批号：43323)；雌二醇(E2)Elisa测定试剂盒、孕酮(P)Elisa测定试剂盒、6-keto-PGF1αElisa测定试剂盒、TXB2Elisa测定试剂盒(批号均为201407)由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 仪器

酶标仪(型号：Synergy 2，BioTek公司)；Labsystems Finnpipette 100 μL单道移液器；Thermo 50 μL 8道移液器；电子天平[型号：BSA3225-CW，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；离心机(型号：LD5-10b，北京雷勃尔离心机有限公司)；电子秤(型号：ACS-D11，上海乾峰电子仪器有限公司)；生物显微镜(XSP-18B，南京江南光学仪器厂)；使用记录全自动凝血分析仪(型号：CA-1500，SYSMEX公司)。

1.4 分组与给药

将大鼠按雌、雄2∶1的比例于下午5点合笼，次日上午8点用蘸取氯化钠注射液的棉棒进行雌鼠阴道涂片，生物显微镜检查，以检出精子为妊娠第1天。未检出精子的雌鼠于当日下午5点继续合笼，连续3 d，最后阴道涂片检出精子的雌鼠共66只。

根据受孕时间和体重随机分为6组，每组11只，分别为正常对照组、模型组、阳性对照组、坤血停低、中、高剂量组。除正常对照组外，其余5组于受孕第7天上午8点灌服米非司酮(剂量为8.3 mg·kg-1)，当日下午5点灌服米索前列醇(剂量为0.1 mg·kg-1)，以造成早孕大鼠不完全流产模型。

正常对照组在相同时间灌服同体积0.5% CMC-Na。第8天开始，正常对照组和模型组均灌服0.5%CMC-Na；阳性对照组灌服宫血宁(剂量为0.13 g·kg-1)；坤血停低、中和高三个剂量组分别灌服剂量为2.0、4.0、8.0 g·kg-1的坤血停。大鼠每天给药1次，连续给药7 d，给药体积均为每100 g体重给药1.0 mL。

1.5 子宫出血量测定

受孕第7天下午5点，给大鼠灌服米索前列醇后，于其阴道内置入定量棉球1个(棉球重70～ 80 mg)。次日上午8点取出，置换一个新棉球于阴道内，当日下午5点将棉球取出，同时再放置一个新棉球。取出棉球放入塑料袋中密闭，置4 ℃冰箱冷藏保存，每天同样操作，连续至受孕第14天。

将收集的每鼠子宫出血棉球置于烧杯内，采用质量浓度为50 g·L-1的氢氧化钠(NaOH)溶液10 mL，分次浸泡、挤压、搓洗棉球。先浸洗血量较少的棉球，再浸洗血量较多的棉球，合并浸洗液，混匀，800 rpm离心5 min。分别将浸洗液和含大鼠静脉血20 μL的NaOH溶液，用酶标仪在546 nm波长测定吸光度。阴道出血量计算公式：阴道出血量(mL)=(静脉血量0.02 mL)×(棉球浸洗液吸光度×V2)/静脉血吸光度×V1)，其中V1为稀释静脉血所用的NaOH溶液的量(4 mL)，V2为浸提子宫出血棉球所用NaOH溶液量(10 mL)。

1.6 大鼠血标本的采集

大鼠受孕第14天，于给药后30 min，用10%水合氯醛腹腔注射(每100 g体重给药0.35 mL)，麻醉大鼠，腹主动脉取血，以0.109 M柠檬酸钠溶液抗凝分离血浆，取5 mL全血分离血清，并取20 μL全血加入质量浓度为50 g·L-1的NaOH 溶液(4 mL)中，混匀，用于阴道出血量测定时使用。

分离血浆由全自动凝血分析仪测定凝血指标：凝血酶原时间(PT)、部分活化凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)。

分离血清，按试剂盒说明进行操作。酶标仪测定E2、P、TXB2和6-Keto-PGF1α水平。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 对血浆凝血指标及子宫出血量的影响

流产模型组大鼠次日开始可见子宫出血，PT、TT、APTT较正常对照组明显延长(P<0.05或P<0.01)。坤血停低、中、高剂量组子宫出血量均明显减少(与模型组比较P<0.01)；中、高剂量组的PT、TT明显缩短(与模型组比较P<0.05或P<0.01)；而高剂量组的APTT有一定的缩短趋势，但与模型组相比，差异无统计学意义。阳性药宫血宁组的PT、TT和APTT均明显缩短，子宫出血量也有明显减少(与模型组比较P<0.05)。结果表明坤血停和阳性药宫血宁对大鼠药物流产后的子宫出血均具有明显的止血作用。结果见表1。

表1 坤血停对药物流产大鼠子宫出血及凝血指标的影响

注：模型组与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；给药组与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。下同。

2.2 对雌性激素水平的影响

血清雌二醇和孕酮检测结果表明，药物流产模型组大鼠与正常对照组比较，其雌二醇及孕酮水平明显降低(与正常组比较P<0.01)。坤血停中、高剂量组及阳性药组给药后能够显著升高雌二醇水平(与模型组比较P<0.05或P<0.01)；而坤血停低、中剂量组及阳性药宫血宁组均未显示出对孕酮水平的影响，坤血停高剂量组才显示出升高孕酮水平(与模型组比较P<0.05)，见表2。

2.3 对血清中TXB2和6-keto-PGF1α的影响

结果显示，模型组大鼠血清TXB2含量显著降低(与正常组比较P<0.05)，而血清6-keto-PGF1α含量显著升高(与正常组比较P<0.05)。TXB2/6-keto-PGF1α比值亦显著降低，说明模型组大鼠中TXB2/6-keto-PGF1α系统失调，表明造模成功。给药后，坤血停中、高剂量组及阳性药组均能够显著升高TXB2水平(与模型组比较P<0.05或P<0.01)，提升TXB2/6-keto-PGF1α比值，说明坤血停中、高剂量组能够通过调节TXB2/6-keto-PGF1α比值，起到治疗的作用。见表3。

表2 坤血停对药物流产大鼠血清雌性激素水平的影响

表3 坤血停对药物流产大鼠血清TXB2和6-keto-PGF1α的影响

3 讨论和结论

传统中医认为流产乃本虚标实之证，概括起来主要有“瘀、热、虚、郁”四个方面，如若防治不当，易引起子宫出血，导致“产后恶露不行”或“崩漏”。其发病机理主要为冲任不固、气血运行失常。病机的关键是“瘀血留滞胞中”，但又有“多虚、多瘀”的特点，故临床组方常以“益气活血、化瘀止血”为原则[4]。复方坤血停是临床用于产后“崩漏”的经验方，方中以蒲黄化瘀止血，五灵脂祛瘀止痛，共同作为君药；当归甘温，既能补血又能活血，为臣药；三七等药行气活血，共为佐药。全方药味组成具有益气活血、化瘀止血之功能，使胞宫内瘀血尽去，新血归经，恶露自止。现代医学认为，出血时间长、出血量多是临床上流产后最常见的并发症，其原因较为复杂，不仅与体内凝血因子有关，而且和体内性激素水平也存在联系[5]。

凝血因子TXB2和6-K-PGF1α都是不稳定花生四烯酸代谢产物，其中TXB2是花生四烯酸转化物血栓素的代谢产物，具有促进血小板聚集、促凝和收缩缩血管作用。而6-K-PGF1α为花生四烯酸转化成前列环素的代谢产物，具有较强的血小板聚集作用，二者在体内维持着动态的平衡，对维持血管张力、防止血小板聚集起着重要作用，一旦平衡失调，可造成血栓或出血倾向。已有研究发现，药物流产后体内TXB2/6-Keto-PGF1α系统失调是导致流产后出血的机制之一[6]，调整该系统至正常范围将能够有效抑制流产后出血。

孕酮和雌二醇分别为体内卵巢分泌的天然孕激素和雌激素。孕酮主要引起子宫内膜产生分泌期的变化，如腺体扩张、分泌增加、血液供应丰富、内膜发育生长等；而雌二醇在体内具有促进子宫内膜增生，增强子宫滑肌收缩及抗雄性激素等作用。临床常用的致流产药物米非司酮作为孕激素受体水平的抗孕激素药[7]，与孕激素竞争抗孕激素受体而达到抗孕激素作用，引起蜕膜和绒毛变性坏死，导致流产和出血。同时米非司酮还可抑制卵巢发育[8]，使得雌二醇水平低下，影响子宫内膜修复，导致出血时间延长。因而调整药物流产后孕酮和雌二醇等性激素水平，促进子宫复旧、修复子宫内膜是治疗流产后“崩漏”的重要环节[9-10]。

本实验结果表明，复方坤血停能够明显增加大鼠血浆中TXB2的含量，升高TXB2/6-Keto-PGF1α值，通过促进血小板聚集，收缩子宫内血管而起到止血作用，同时还可以升高药物流产大鼠血清中雌二醇含量，促进子宫内膜的修复，从而进一步减少出血的可能。

[1] 梁爱华，薛宝云，王金华，等.宫宁颗粒治疗药物流产子宫出血的实验研究[J].中国实验方剂学杂志，2007，13(2)：55-57.

[2] 王晓东，赵军宁，张白嘉，等.药物致早孕大鼠子宫出血模型的建立[J].中国药理学通报，1999，15(2)：182-1841.

[3] 王晓东，赵军宁，张白嘉，等.宫复安对子宫的药理作用研究[J].中药药理与临床，1999，15(1)：33-35.

[4] 武权生，宋燕，杨亚玲，等.清宫止血合剂对药物流产后大鼠血浆TXB2和6-Keto-PGF1α影响的实验研究[J].甘肃中医学院学报，2008，25(1)：6-8.

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Effect of Fufang Kunxueting on Function of Coagulationand Serum level of Sex Hormone in Rats Model of Medical Abortion

YANG Mei1,2，LENG Kang1，WANG Meng1，ZHENG Yunfeng1，CHENG Jianming1，CHEN Xiangyu1,3*

(1.Nanjing University of Chinese Medicine，210029，China；2.Nanjing Maternity and Child Health care hospital，Nanjing，210004，China；3.Nanjing Drum Town hospital，Nanjing，210008，China)

Objective：To evaluate the effect of Fufang Kunxueting on the coagulation function and its mechanism in rats model of medical abortion.Methods：Incomplete abortion was induced in pregnant rats by perfusion of mifepristone and misoprostol.Then the level of coagulation factor and the amount of uterine haemorrhage were investigated.The change of serum level of E2，P，TXB2and 6-Keto-PGF1αin model rats was determined.Results：The results showed that Fufang Kunxueting could decrease the amount of uterine haemorrhage，shorten the PT and TT，and improve the serum level of TXB2and E2 in model rats(P<0.05，P<0.01).Conclusion：Fufang Kunxueting could decrease the risk of the abnormal uterine bleeding，and its mechanism may closely relate with the regulation on coagulation factor and sex hormone.

Kunxueting；medical abortion；uterine haemorrhage；coagulation function；sex hormone level

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.004

2014-11-03)

江苏省科技厅产学研联合创新资金—前曕性联合研究项目(BY2014008-01)

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陈湘玉，主任护师；E-mail：gycc2011@126.com