WWOX及P73蛋白在皮肤恶性黑色素瘤中的表达及意义

梁　艳，牛扶幼，范海霞，张智棋

（郑州大学第一附属医院整形外科河南郑州450052）

WWOX及P73蛋白在皮肤恶性黑色素瘤中的表达及意义

梁艳，牛扶幼，范海霞，张智棋

（郑州大学第一附属医院整形外科河南郑州450052）

目的：探讨WW结构域氧化还原酶基因（WW domain-containing oxidoreductase gene，WWOX）与P73蛋白在皮肤恶性黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）中的表达及其意义。方法：采用免疫组化法（SP）检测66例CMM、30例交界痣和20例正常皮肤组织蜡块中的WWOX、P73蛋白表达水平。使用SPSSl7.0统计软件包，采用卡方检验和Spearman等级相关分析方法进行统计学分析，检验标准a=0.05，以P＜0.05为有统计学意义，χ2分割检验标准0.0167。结果：WWOX在正常皮肤的表达水平明显高于交界痣，其在交界痣的表达水平明显高于在CMM中的表达（P＜0.0167）；CMM中WWOX的表达水平随肿瘤浸润深度的增加而降低，伴有淋巴结转移者中的表达水平低于不伴有淋巴结转移者，并且差异均具有统计学差异（P＜0.05）。P73蛋白在正常皮肤的表达水平低于交界痣，其在交界痣的表达水平低于CMM（P＜0.0167）；CMM中的P73蛋白表达水平随肿瘤浸润深度的增加而增高，伴有淋巴结转移者中的表达水平高于不伴有淋巴结转移者中的表达水平（P＜0.05）。WWOX与P73蛋白在CMM中的表达呈负相关（r=-0.298，P=0.015）。结论：WWOX与P73共同参与调控CMM的发生发展，对其进行联合检测，有助于CMM的早期诊断，为临床治疗提供参考指标，同时也为CMM的基因治疗提供一个新思路。

皮肤恶性黑色素瘤；WW结构域氧化还原酶基因；P73蛋白

皮肤恶性黑色素瘤（CMM），是致死率位居皮肤肿瘤之首的源于皮肤黑色素细胞的高度恶性肿瘤。近年来我国CMM的发病率显著增加，病死率也随之增加［1］。研究表明CMM的发生是一个复杂的病理过程，以癌基因的激活和抑癌基因的失活为主要发生机制之一［2］。WWOX基因是近年来发现的一个可能的肿瘤抑制基因，跨越了整个常见染色体脆性位点FRAl6D，在许多人类恶性肿瘤中表达减少或缺失［3］。P73是法国Kaghad科学家发现的P53家族的一个成员，定位于人类1号染色体短臂着丝粒1p36.33区域。P73自发现之日起一直被认为是抑癌基因，但是近些年多数研究发现肿瘤中的P73高表达、双等位基因、突变少，故产生这样的疑问：P73在CMM的发生发展中起促进作用还是抑制作用。笔者应用免疫组化法检测了CMM组织中WWOX和P73的表达，旨在探讨它们在CMM发生发展中的意义及相互关系［4］。

1　资料和方法

1.1临床资料

本实验采用回顾性研究方法，标本来自郑州大学第一附属医院2009年1月-2013年9月存档于病理科的蜡块：皮肤恶性黑色素瘤66例，交界痣20例。66例CMM中男性：36例，女性30例，年龄集中在28～64岁，平均（54.69.6）岁；病变部位见于足底、手指甲下、下肢，病程3～15月；依据有无淋巴结转移（以前哨淋巴结活检结果划分）将皮肤恶性黑色素瘤患者分为：伴淋巴结转移者31例，未伴淋巴结转移者35例；按照肿瘤细胞浸润深度Clark分级法分为：15例为I级：表皮及附属器上皮，19例为II～III级：真皮乳头层，21例为Ⅳ级：真皮网状层，11例V级：侵及皮下组织。30例交界痣中男性：19例，女性11例，年龄集中在26～58岁，平均年龄为（40.68.9）岁，病变部位见于足部、手掌、面部，病程为3月～50年。以本院整形外科手术中剩余的20例全厚皮片作为对照组。所有以上实验对象均具备完整的病历资料，均不伴有结蹄组织病、皮肤病、免疫缺陷等其他相关疾病，术前均未行如下治疗：液氮冷冻、射线照射、激光等其他相应治疗，且各组患者的病变部位、病程、性别和年龄等之间的差异无统计学意义。

1.2试剂和方法

浓缩型兔抗人WWOX单克隆抗体购买自北京博奥森生物技术有限公司，抗体稀释浓度为1:100；浓缩型兔抗人MDM2单克隆抗体购买自北京博奥森生物技术有限公司，抗体稀释浓度为1:100，以染色阳性的CMM组织切片做阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3染色结果判断

黄色颗粒至棕黄色颗粒的WWOX蛋白主要表达于细胞浆：P73蛋白集中表达于胞核内，呈棕黄色颗粒。本实验染色结果判定标准参照Feomowitz阳性细胞半定量分级法。随机选取5个高倍镜下视野，每个视野计数100个细胞。①根据阳性细胞面积进行分级，视野为0分的呈阴性，1分的视野为：阳性细胞面积/细胞总面积＜25%，2分的视野为：26%～50%，3分的视野为：51%～75%，4分的视野＞75%的视野；②根据着色强弱进行分级，0分的视野不着色，1分的视野与背景色一致，2分的视野呈浅黄色，3分的视野呈深黄色，4分的视野呈棕黄色。两者定性分乘积为0～1分表达阴性，≥2分为阳性表达。

图1　WWOX在正常皮肤中的表达（SP，×400）

图2　WWOX在交界痣中的表达（SP，×400）

图3　WWOX在CMM中的表达（SP，×400）

图4　P73在正常皮肤中的表达（SP，×400）

图5　P73在交界痣中的表达（SP，×400）

图6　P73在CMM中的表达（SP，×400）

表1　WWOX在三种组织中的表达

表2　P73在三种组织中的表达

1.4统计学分析

采用SPSSl7.0处理实验数据，运用卡方检验比较WWOX、P73蛋白的表达水平，同时探究其在CMM中的阳性表达率与临床病理特征之间的关系，并分析CMM组织中两种蛋白表达的相关性，有统计学意的P＜0.05，χ2分割检验标准P´=0.0167。

2　结果

2.1WWOX在CMM、交界痣及正常皮肤组织中的表达

棕黄色颗粒状的WWOX主要表达于细胞浆内。WWOX在CMM、交界痣到正常皮肤中的表达逐渐增强，分别为15.15%（10/66）、46.67%（14/30）和85.00%（17/20），WWOX在三组中的表达水平有差异，并且差异具有统计学意义（P＜0.001），三组间两两比较的结果显示：WWOX蛋白在正常皮肤的表达水平明显高于交界痣，其在交界痣的表达水平明显高于CMM，差异具有统计学意义（P＜0.0167）。见表1，图1～3。2.2 P73在CMM、皮肤交界痣及正常皮肤组织中的表达［5］

棕黄色颗粒的P73蛋白主要集中在胞核内，P73蛋白在CMM、交界痣到正常皮肤的表达逐渐降低，分别为78.79%（52/66）、46.67%（14/30）、10%（2/20），P73蛋白在三组中的表达水平有差异，且差异有统计学意义（P＜0.001），三组间两两比较的结果显示：P73蛋白在正常皮肤的表达水平低于交界痣，其在交界痣的表达水平低于CMM（P＜0.0167）。见表2、图4～6。

表3　WWOX在CMM组织中的表达与临床病理学特征的关系

表4　P73在CMM组织中的表达与临床病理学特征的关系

2.3WWOX、P73的表达与CMM病理学特征的关系

2.3.1CMM组织中WWOX的表达水平随肿瘤细胞浸润深度的增加而降低，同时伴有淋巴结转移者的表达水平低于不伴淋巴结转移者，并且差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.3.2CMM组织中P73的表达水平随肿瘤细胞浸润深度的增加而增高，同时伴有淋巴结转移者的表达水平高于不伴淋巴结转移者，并且差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

2.4CMM中WWOX与P73蛋白的表达关系

CMM组织中的WWOX和P73蛋白均表达阳性的病例共5例，均阴性表达的9例；WWOX表达阴性的47例病例，P73均呈阳性表达；P73表达阳性的5例病例，WWOX均呈阴性表达。二者的表达呈负相关（r=-0.298，P=0.015）。见表5。

表5　CMM组织中WWOX和P73蛋白表达的关联性

3　讨论

3.1WWOX与CMM

WWOX基因是由Bednarek等在染色体脆性位点FRA16D（16C23.3-24.1）区域克隆出的一个的基因。9个外显子存在于WWOX基因，其蛋白大小为46kDa。在结构上，WWOX具有与YES等蛋白功能相似的WW结构域，以与配体结合的方式介导蛋白一蛋白的相互作用，因为该结构富含高保守的氨基酸残基［6］。本实验发现棕黄色颗粒的WWOX主要集中在细胞浆，且WWOX在CMM、交界痣、正常皮肤中的表达时发现：其在CMM中低表达，从CMM、皮肤交界痣到正常皮肤，WWOX蛋白的表达逐渐增强，且WWOX在三组中的表达率不同，并有统计学意义（P=0.000）；三组间两两比较结果还显示:WWOX在交界痣的表达阳性率明显高于CMM，其在正常皮肤的表达阳性率高于交界痣，并且差异均具有有统计学意义（P＜0.0167），这均与已知研究基本一致，可以推测WWOX在CMM中表达下调，与皮肤黑色素细胞恶变、CMM的发生发展有关，可以作为一个监测CMM发生发展的指标。本实验还发现：随肿瘤细胞浸润深度的增加，WWOX的表达阳性率降低，而且伴有淋巴结转移者的表达水平低于不伴淋巴结转移者的，差异均有统计学意义（P＜0.05），可以推测WWOX表达缺失促进了CMM的浸润转移，可以作为监测转移的一个指标。

3.2P73与CMM

P73是法国科学家Kaghad等在选取胰岛素信号传递的介导因子时发现的一个假阳性cDNA克隆，编码与P53蛋白显著同源的蛋白，P73自从发现之日起一直被寄希望是抑癌基因。但近些年的大量研究表明P73扮演的并不是单纯的抑癌基因角色，而在某些肿瘤中，其表现出的是癌基因的特性［7］。通常所说的P73是TAp73，Np73与TAp73异互为构体蛋白，二者相比，TAp73具有转录激活结构域，而Np73则没有。TAp73与P53的功能相似，诱导细胞凋亡，表现的抑癌基因的特性；而Np73促进肿瘤发生，表现出癌基因的促癌作用。在本实验中，从CMM、皮肤交界痣到正常皮肤P73蛋白的表达逐渐降低，在CMM中表达最高，在正常皮肤中表达最低；随浸润深度的增加，CMM中P73蛋白的表达水平而升高（P＜0.05）；和不伴有淋巴结转移者相比，伴有淋巴结转移者中的表达水平较高（P＜0.05），可推测P73高表达促进了CMM的发生发展浸润转移［8-9］。

3.3WWOX与P73蛋白在CMM中表达的相关性

研究表明：WWOX扮演抑癌基因角色时，WWOX不仅直接抑制癌基因的促癌作用，而且也能激活抑癌基因如P53的促凋亡作用；作为细胞外信号转导通路的传感器，WWOX通过WW结构域与富含PPxY的P73相结合进行细胞外信号转导（有足够的WWOX）［10］。本实验中P73蛋白与WWOX在CMM中的表达呈负相关（P＜0.05），可推测CMM中表达减弱或缺失的WWOX通过WW结构结合富含PPxY的P73相结合进行细胞外信号转导，增强了高表达的扮演癌基因角色P73的转录，促进了CMM的发生［11］。随着CMM的进展，WWOX表达降低，WWOX参与的细胞外信号转导通路不再发挥作用（没有足够的WWOX），此时表现癌基因特性的P73促进CMM的浸润转移。

综上所述，WWOX及P73参与了CMM的发生发展，联合检测WWOX及P73可能有助于CMM的早期诊断、治疗、预后评价，并可能成为基因治疗的新靶点。

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编辑/张惠娟

Expression of WWOX，MDM2 and P73 protein in cutaneous malignant melanoma

LIANG Yan，NlU Fu-you，FAN Hai-xia，ZHANG Zhi-qi
（Department of Plastic Surgery，The first Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，450052，Henan，China）

Objective To study the expression and correlation of WWOX and P73 protein in cutaneous malignant melanoma.MethodsRetrospective method was used in the study.The expression level of WWOX and p73 was determined using immunohischemistry staining in 66 cases of cutaneous malignant melanoma，30 cases of junctional nevus and 20 cases of normal skin tissues.The results were analyzed using chi-squared test and Spearman rank correlation test.P＜0.05 is considered statistically significant.P=0.0167 used for chi-squared test.All statistical analyses were performed using SPSS17.0.Results The positive rate of WWOX protein in CMM is significantly lower than thatin junction nevus，and the positive rate in junction nevus is significantly lower than that in normal skin（P＜0.0167），with the depth of tumor infiltration increasing，the expression of WWOX in CMM has decreased（P＜0.05），the expression of WWOX in the tissue with lymph node metastasis is significantly lower than that without lymph node metastasis（P＜0.05）.The positive rate in normal skin was less lower than that in junction nevus，and the positive rate in junction nevus was less lower than that in CMM（P＜0.0167），with the depth of tumor infiltration increasing，the expression of P73 in CMM has increased（P＜0.05），the expression level of P73 in the tissue with lymph node metastasis is significantly higher than that without lymph node metastasis（P＜0.05）.Conclusion WWOX and P73 might play an important role in occurrence and development of CMM，The combined detection of WWOX and P73 might be helpful for early diagnosis of CMM，to provide reference for clinical treatment and supply a new way for gene therapy of CMM.

cutaneous malignant melanoma（CMM）；WW domain-containing oxidoreductase（WWOX）gene；P73

R739.5

A

1008-6455（2015）11-0047-05

牛扶幼，河南省，郑州市，郑大一附院整形外科教授，主任医师；主要研究方向：皮肤癌；邮编：450052

2015-03-22

2015-05-14