A型肉毒毒素对增生性瘢痕组织中TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达的影响

武凤莲,朱东来,蒋韬,王连英

A型肉毒毒素对增生性瘢痕组织中TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达的影响

武凤莲,朱东来,蒋韬,王连英

(秦皇岛市第一医院烧伤整形外科河北秦皇岛066000)

目的:探讨A型肉毒毒素(botulinum toxin A,BTXA)对增生性瘢痕组织成纤维细胞中TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响.方法:组织块法培养增生性瘢痕组织及正常皮肤组织的成纤维细胞,用不同浓度的BTXA作用于体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞,检测MTT值;将浓度为0.2U/ml、0.4U/ml、0.8U/mlBTXA作用于增生性瘢痕成纤维细胞48h,利用RT-PCR检测BTXA对TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达量.结果:BTXA在体外能明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,随着药物浓度的增加及时间的延长,其抑制作用明显增强,能够减少TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达,且随着药物浓度的增加,TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达量呈下降趋势.结论:BTXA通过抑制瘢痕组织中成纤维细胞的增殖,减少TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达,减少细胞外基质的异常沉积来影响增生性瘢痕的形成.

A型肉毒毒素;增生性瘢痕;TGF-β1;collagenⅠ

A型肉毒毒素(botulinum toxin type A,BTXA)是由肉毒梭菌产生的一种神经毒性药物,它能够持久的抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放而使肌肉松弛麻痹,其这一原理已用于治疗肌张力障碍及肌肉痉挛性的疾病[1].近来又有研究发现A型肉毒毒素并不只单纯作用于胆碱能神经末梢,在平滑肌和腺体亦可以通过抑制胆碱能或非胆碱能神经递质发挥作用[2].目前有研究用A型肉毒毒素治疗瘢痕及抑制瘢痕增生取得了较好的临床治疗效果[3-5].本研究通过BTXA对体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞的形态和增殖变化的影响,以及TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达的影响,为其在瘢痕防治领域里提供理论依据.

1　材料和方法

1.1实验材料

DMEM培养基(Gibco公司USA),BTXA(兰州生物制品研究所),Trizol总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(美国PROMEGA公司),taq酶购于日本TAKARA;MTT、DMSO购于SIGMAUSA,新生小牛血清(天津TBD公司),光学显微镜,投射电镜,PCR仪器.

1.2实验标本

标本取自本科室2012-2014年18例增生性瘢痕患者手术切下的增生性瘢痕组织及正常的皮肤组织,患者年龄14～45岁,平均年龄32岁;病程6个月～2年,患者3个月内均未经过免疫治疗,放射线治疗及激光治疗,取标本前均得到患者的知情同意.

1.3细胞培养

将增生性瘢痕组织及正常的皮肤组织标本在无菌室用含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的PBS缓冲液反复冲洗3次后将其剪成0.5mmX0.5mmX 0.5mm～1mmX1mmX1mm大小的小组织块,接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液的培养方瓶中,在37.0℃、5%(体积分数)的CO2孵箱中静置培养,根据细胞的生长情况,每周更换两到三次培养液,待3周后原代细胞从组织块中长出并融合成致密的单层,进行传代,采用0.25%胰蛋白酶及0.02%乙二胺四乙酸消化,按1∶4传代,药物实验所用细胞为3～6代.

1.4MTT比色法检测各组细胞增殖情况

将对数生长期的成纤维细胞制成5X106悬浮液,以每孔100μl的成纤维细胞密度接种于96孔培养板中.置于37.0℃、5%(体积分数)的CO2饱和温度的孵箱中继续孵育24h.待细胞完全贴壁后去除培养液,分别加入含浓度(U/ml)0,0.1,0.2,0.4, 0.8,1.6 BTXA的10%小牛血清的DMEM 200μl,培养液每组设6个平行孔及空白对照孔,加药继续孵育48h后,每孔加MTT(5mg/ml)20μl继续孵育3h后,弃掉上清液,每孔加200μl DMSO振荡混匀,用自动酶联免疫分析仪在设定波长492nm时测定其OD值.计算药物的抑制率(IR):

IR=(1-实验组OD值/对照组OD值)X100%

1.5总RAN的提取

将浓度为0.2 U/ml、0.4 U/ml、0.8 U/ml的BXTA加入含有1X106个/ml第3～6代细胞的培养瓶中,孵育48h,收获细胞.采用TRizol Reagent总RNA抽提试剂盒,操作步骤按试剂盒的操作指南进行.并电泳鉴定提取RNA的完整性.经检测所有样本260/ 280nm比值均大于1.8,提示样品纯度较高,-80℃储存.

1.6MT-RT-PCR

TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白和β-actin基因表达的变化采用半定量RT-PCR方法.首先用Promega公司的逆转录试剂盒(A3500),按说明书操作指南进行cDNA的合成.MT-RT-PCR反应体系为25μl,构成如下:10Xbuffer 2.5μl,dNTP 2μl,模板4ug,特异性引物上下游各1μl,β-actin上下游引物各1μl,Taq酶2.5U,加水至总反应体积25μl.扩增条件:95℃预变性5min,95℃变性30S,退火温度见表1,72℃延伸1min,40个循环,最后72℃再延伸10min终止反应.

1.7PCR产物分析

取10μl PCR产物在15g/L琼脂糖凝胶电泳分析,用凝胶扫描成像分析仪处理系统扫描各条带紫外光吸收量(Vol).目的基因Vol值与相应内参βactin Vol值的比值代表每个样本PCR扩增产物mRNA的相对表达量,测定并比较增生性瘢痕与正常皮肤,以及加入肉毒毒素作用后增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1及Ⅰ胶原蛋白基因的表达的变化.

1.8统计学分析

数据以x±s表示,采用SPPS13.0软件,用t检验法,P<0.05表示差异有统计学意义.

2　结果

2.1BTXA对增生瘢痕成纤维细胞形态的影响

光镜下可见对照组成纤维细胞铺满视野,梭形细胞间紧密接触,加浓度为0.2 U/ml BTXA培养液处理48h后,光镜下可见细胞体积开始缩小、变短,树突状突起回缩细胞间隙逐渐增大;当浓度达0.4 U/ml时,细胞体积缩小明显;BTXA浓度达到0.8 U/ml时细胞体积缩小更加明显,形态变圆,部分细胞从瓶底脱壁漂浮.投射电镜下可见对照组成纤细胞核较大并且核仁明显,细胞质中细胞器正常,细胞膜完整.加BTXA处理后可见部分细胞的胞膜皱缩,细胞内可见空泡,细胞核不规则,染色质浓缩,可见凋亡小体,细胞呈早期凋亡状态.随着药物浓度的增加,镜下可见到部分凋亡晚期、细胞核固缩机坏死的成纤维细胞.

2.2BTXA对成纤维细胞增殖的影响

增生性瘢痕成纤维细胞加入浓度0.1～1.6 U/ml的A型肉毒毒素的细胞培养液48h、72h后,用MTT法检测细胞增殖的变化.结果显示,同一观察时间,随着BTXA浓度的增大,成纤维细胞的增殖能力明显受到抑制;且同一药物浓度作用后,随着时间的延长,其抑制率显著增高,见表2.

2.3正常皮肤与增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原的表达

增生性瘢痕成纤维细胞中的TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白的相对表达量与正常皮肤的表达相比呈显著升高趋势,有显著性意义(P<0.01)见表3.

2.4BTXA对增生性瘢痕TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达的影响

对用浓度分别为0.2 U/ml、0.4 U/ml、0.8 U/ml BTXA的培养液培养48h的成纤维细胞进行RT-PCR, TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白mRNA的相对表达量与对照组相比明显下降,随着药物浓度的增加,TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达呈下降趋势,有显著性意义(P<0.05);高浓度组(0.8 U/ml)与低浓度组(0.2 U/ml)相比较,TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达明显下降,有显著性意义(P<0.01)见表4.

表1　用primer5.0辅助设计引物

表2　不同浓度BTXA对细胞抑制率随时间变化情况比较(±s,n=6)

表2　不同浓度BTXA对细胞抑制率随时间变化情况比较(±s,n=6)

注:对照组与各浓度组比较P<0.001,不同时间组比较P<0.05

浓度(U/ml)抑制率(%) 48h(a)72h(b) 0(对照)00 0.15.34±0.02817.94±0.0156 0.214.51±0.01318.93±0.0102 0.425.65±0.04145.35±0.0287 0.850.42±0.02470.05±0.0231 1.670.01±0.02183.48±0.0257 BTXA

表3　TGF-β1和Ⅰ型胶原mRNA在增生性瘢痕和正常皮肤中的表达

表4　各组增生性瘢痕TGF-β1和Ⅰ型胶原mRNA的表达

3　讨论

增生性瘢痕是皮肤软组织创伤、深度烧伤后皮肤软组织病理性修复的结果,轻者影响美观,重者可致器官的功能障碍,给患者带来极大的心理创伤,严重影响其生活质量.因此探索增生性瘢痕的形成机制及寻找有效的理想的防治方法成为迫切而艰巨的任务.增生性瘢痕是病变部位以胶原等细胞外基质过度产生和沉积为病理学特征的疾病,其中来源于成纤维细胞的Ⅰ型胶原蛋白所占的比例较大,以Ⅰ型胶原蛋白的过度沉积为主要特征[6].随着细胞生物学及分子生物学的快速发展,成纤维细胞被认为是增生性瘢痕形成过程中的主要效应细胞,其能够合成并分泌胶原基质,促进创面的愈合.当成纤维细胞增殖,持续过度分泌胶原蛋白则会产生大量的Ⅰ型胶原蛋白,并异常沉积于创面最终形成增生性瘢痕.成纤维细胞在增生性瘢痕的形成过程中,会受细胞因子、低氧、免疫因素、神经肽物质等到多种因素的作用后发挥其效应.其中TGF-β1是目前在已知的细胞因子中促进瘢痕形成的最重要的细胞因子[7-8].TGF-β1是一种具有多种生理功能的多肽,能导致组织纤维化,也能诱导肉芽组织中成纤维细胞表达高水基质蛋白[9].在创面愈合早期,除了TGF-β1,会有其他因子参与瘢痕的形成,在中后期,TGF-β1成为瘢痕形成的主要因素,其通过自身诱导功能和诱导细胞外基质沉积的功能,提高整合素的表达,通过改变其细胞膜上的相对比例,增大对基质的粘附促进创面修复;是成纤维细胞的强趋化因子,可通过旁分泌及自分泌直接或间接、单独或协同作用与炎症并修复细胞,产生细胞的趋化性迁移,增殖分化;TGF-β1也可以直接作用于成纤维细胞,促进基质蛋白的合成.同时TGF-β1是Ⅰ型胶原蛋白的强有效多基因代码诱导剂[10].TGF-β1与细胞表面特异性的受体结合后使调节蛋白的丝氨酸和苏氨酸碱基磷酸化,从而激活Ⅰ型胶原启动基因的表达[7],刺激Ⅰ型胶原的合成分泌,引起细胞内外Ⅰ型胶原的明显积聚,最终导致创面成纤维细胞胶原合成异常.故TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白在创面愈合时增生性瘢痕形成过程中处于至关重要的中心枢纽作用.如何干扰TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白在增生性瘢痕形成中作用,成为防治增生性瘢痕的重点.

目前,临床应用A型肉毒毒素治疗增生性瘢痕,可以抑制瘢痕的增生挛缩,减轻疼痒症状,并且能够使瘢痕萎缩变平[11].但其具体机制尚不清楚.本实验通过体外细胞培养,瘢痕组与对照组比较,增生性瘢痕中的TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白的表达水平明显升高(P<0.05),进一步说明两者是增生性瘢痕形成的重要因素.本实验用MTT比色法证明BTXA在体外能够明显抑制瘢痕的成纤维细胞的增殖(P<0.001),且具有药物浓度的依赖性,及药物作用时间点不同的依从性.本实验分别用浓度分别为0.2 U/ml、0.4 U/ml、0.8 U/ml BXTA的培养液培养成纤维细胞48h,与对照组比较,TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白的mRNA的表达下降(P<0.05),高浓度组BTXA(0.8 U/ml)与低浓度组BTXA(0.2 U/ml)比较,TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白的mRNA相对表达量明显下降(P<0.01),具有药物的浓度的依赖性.以上结论说明BTXA能够抑制增生性瘢痕成纤维细胞中TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白的mRNA表达,减慢增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,并且使成纤维细胞减少大量胶原的合成,减轻组织的纤维化,进而减轻瘢痕的增生.本研究为BTXA在临床上治疗及预防增生性瘢痕提供了实验依据,但其治疗及预防增生性瘢痕时,其作用的具体靶点、环节及确切机制仍需要更深层次及大量的临床及实验研究来证实.

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编辑/张惠娟

Study on BTXA on the expression of TGF-β1 and collagenⅠin hypertrophic scar

WU Feng-lian,ZHU Dong-lai,JIANG Tao,WANG Lian-ying
(Department of Burn and Plastic Surgery,The First Hospital of Qinhuangdao,Qinhuangdao 066000, Hebei,China)

ObjectiveTo investigate the effect of botulinum toxin A(BTXA)on the expression of TGF-β1 and collagenⅠin hypertrophic scar fibroblast.Methods After treated with different concertrations of BTXA,the inhibition rate of hypertrophic scar fibroblasts were detected by MTT assay,0.2U/ml,0.4 U/ml and 0.8U/ml of BTXA was added in cultured hypertrophic scar fibroblast for 48h,the expression of TGF-β1and collagenⅠin hypertrophic scar fibroblasts was respectively detected with RT-PCR.Results BTXA can significantly inhibit the proliferation of hypertrophic scar fibroblast,and the expression of TGF-β1and collagenⅠcould be inhibited significantly,the levels of the proliferation of hypertrophic scar fibro⁃blast and the expression of TGF-β1and collagenⅠdecreased along with the increase in BTXA concer⁃tration.Conclusion BTXA inhibits hypertrophic scar formation through inhibiting the proliferation of hy⁃pertrophic scar fibroblast and down-regulating the expression of TGF-β1 and collagenⅠ.

botulinum toxin A;hypertrophic scar;TGF-β1;collagenⅠ

Q813.1

A

1008-6455(2015)07-0040-04

王连英,主任医师,河北省秦皇岛市,秦皇岛市第一医院,烧伤整形外科,邮编:066000

2015-03-06

2015-04-13