乙酰化二淀粉己二酸酯与豆浆体系在腐竹揭膜中的相互作用机理

谢丽燕，林莹*，吴亨，徐晓辉，朱雪琼

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

乙酰化二淀粉己二酸酯与豆浆体系在腐竹揭膜中的相互作用机理

谢丽燕，林莹*，吴亨，徐晓辉，朱雪琼

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

采用差示扫描量热仪、荧光分光光度计及扫描电镜等仪器方法对乙酰化二淀粉己二酸酯在腐竹揭膜过程中与豆浆的相互作用机理进行研究。结果表明，乙酰化二淀粉己二酸酯主要是以镶嵌的形式填充在蛋白质变性形成的网络结构空隙中，增加了蛋白膜的致密性，从而使腐竹的机械性能提高，得率增加。从分子角度分析认为可能是添加乙酰化二淀粉己二酸酯后，使大豆蛋白质分子氢键、表面疏水性及乳化能力增强的结果。

乙酰化二淀粉己二酸酯；腐竹；机理；荧光分光光度计；扫描电子显微镜

腐竹作为中国传统大豆制品，素有“素中之荤”的美名，是大豆制浆后经恒温揭膜得到的。腐竹生产中影响其得率和品质的因素主要有大豆的品种、蛋白质、脂肪和糖类含量［1］、二硫键含量［2］以及豆浆pH值、揭膜温度等［3］。为了提高腐竹的得率和品质，前人做了很多的研究，如对生产工艺进行优化，使用物理、化学、生物的方法对大豆蛋白进行改性等。欧锦强［4］考察了揭膜条件对腐竹得率的影响，朱石龙［5］通过腐竹揭膜实验，优化了腐竹的揭膜工艺条件，同时证明海藻酸钠，大豆卵磷脂等乳化剂具有提高腐竹得率和品质的作用。谢向机［6］使用超声的方法提高了腐竹得率和品质，机理是超声提高了大豆蛋白的溶解度。前人的研究通过实验证明了这些方法在腐竹生产中的可行性，但是对其作用机理的研究很少，未形成对特定方法在腐竹揭膜过程中机理研究的多指标的比较全面而系统的研究结论。此外对将具有交联淀粉和酯化淀粉双重特性的乙酰化二淀粉己二酸酯应用于腐竹生产中的可能及其与豆浆体系相互作用机理的研究还未有报道。通过前期对腐竹揭膜工艺进行优化研究［7］实验，得出揭膜浆液pH值为8.0，脂肪含量/蛋白质含量为0.2，糖类含量/蛋白质含量为0.3，揭膜温度85℃，打浆豆水比1∶7，此时腐竹得率为49.02%（对干豆），水分含量9.12%，蛋白质含量为46.89%，脂肪含量为26.09%，总糖含量12.09%的结论。在此基础上，对乙酰化二淀粉己二酸酯与豆浆体系在腐竹揭膜过程中的相互作用机理进行研究，并使用SPSS17.0、Origin8.0等进行分析，为乙酰化二淀粉己二酸酯应用于传统腐竹生产的可能提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

东北大豆（蛋白质含量32.42%、脂肪含量17.52%、总糖含量15.77%、水分含量11.91%）市售。

乙酰化二淀粉己二酸酯（纯度75%）上海鹤善实业有限公司。

1.2仪器与设备

九阳料理机九阳有限公司；DNJ-8S数字显示黏度计上海精密科学仪器有限公司；MF-30型万用电表兰州东方红电表厂；JYW-200A自动界面张力仪承德市鑫国检测设备公司；722型可见分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司；DSC200PC差示扫描量热仪德国Netzsch公司；DYY-6C型垂直电泳仪北京市六一仪器厂；RF-5301PC荧光分光光度计日本岛津公司；SU-8020/X-MAX/80场发射扫描电子显微镜日立高新技术公司。

1.3方法

1.3.1豆浆的制作

称取市售的东北大豆100g，加入500g蒸馏水在30℃浸泡18h，沥干，加入700g蒸馏水采用九阳料理机打浆，100目纱布过滤得到豆浆。

1.3.2黏度测定

将待测液300mL置于500mL烧杯中，使用DNJ-8S型数字显示黏度计测定待测液黏度，待探头完全浸没于待测液中，黏度计读数稳定后，记录数据，重复测量3次，取平均值。

1.3.3黏度法测定相容性

在固形物质量浓度为5g/100mL的豆浆中分别加入乙酰化二淀粉己二酸酯3、6、9、12、15、18g/700mL，85℃水浴20min后，冷却至30℃及80℃后，依据1.3.2节的方法进行黏度测定。

1.3.4玻璃化转变温度测定

使用差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC）测定玻璃化转变温度，实验条件为干燥腐竹样品10mg，在液氮的作用下首先由常温以15℃/min降至-100℃，然后以10℃/min从-100℃加热至250℃。

1.3.5黏度法测定豆浆体系静电及氢键作用

在固形物质量浓度为5g/100mL的豆浆中，使用0.1mol/L HCl及0.05mol/L NaOH调节豆浆pH值，旋转黏度仪测定不同NaCl、尿素、丙二醇体积分数对豆浆体系在加入5g/100g乙酰化二淀粉己二酸酯前后黏度的变化。

1.3.6豆浆体系乳化性测定

使用电阻法［8］测定其乳化能力。取30mL样液于小烧杯中，在电磁搅拌器剧烈搅抖下滴加大豆油，使用万用电表测定溶液电阻，当溶液电阻值发生跃变时，停止加油，并记录所滴加的大豆油体积数，乳化力以乳化的大豆油体积（mL）表示。乳化液稳定性［9］为样液中加5g/100g大豆油，高速搅拌器5min后，倒入量筒，定时观察其乳化液和油状液的变化，3min后，记录乳化层的体积，以乳化液高度对总样液高度百分比反映乳化液的稳定性。

1.3.7巯基含量测定

巯基含量测定［10］方法为使用0.0074mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液将豆浆稀释到蛋白质质量浓度为1～2mg/mL，待测液4000r/min离心10min，取离心上清液1.5mL，加入0.4mL0.01mol/L的5，5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（5，5’-dithio bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）及0.1mL0.025mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），室温下反应45min后，分光光度计在412nm波长处测定吸光度（半胱氨酸为标样），巯基含量以10-7mol/g pro计。

实验时，在豆浆中分别添加0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/100mL乙酰化二淀粉己二酸酯。

1.3.8表面疏水性测定

实验使用0.01mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液将样品稀释到蛋白质质量浓度为0.5～1mg/mL，取10mL稀释液，加入0.1mL0.01mol/L的8-苯胺-1-萘磺酸（8-naphthylamine-1-sulfonic acid，ANS）溶液，反应2h后，在激发波长380nm，发射波长490nm条件下使用荧光分光光度计测定其荧光强度（fluorescence intensity，FI）。豆浆表面疏水性的变化以相对荧光强度的增加表示。

式中：ΔS/%为疏水性相对变化值；FI为处理样品的荧光强度；FI0为纯豆浆样品的荧光强度。

1.3.9十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）

SDS-PAGE电泳实验根据Laemmli［11］的方法，取研碎的样品0.2g加入50mL蒸馏水电炉加热使之溶解，冷却后取50☒L样品与50☒L预先配好的样品处理液混合，沸水浴煮5min，上样量为15☒L，进行SDS-PAGE。实验采用3%浓缩胶，12%分离胶，浓缩胶电流15mA，进入分离胶后增至25mA，电泳结束后采用考马斯亮蓝R-250染色。

1.4数据处理

采用SPSS17.0、Excel2003、Origin8.0进行系统分析和数据处理。

2　结果与分析

2.1豆浆与乙酰化二淀粉己二酸酯的相容性

2.1.1黏度法测定乙酰化二淀粉己二酸酯与豆浆体系相容性

图1　乙酰化二淀粉己二酸酯的黏度特性Fig.1Viscosity of acetylated distarch adipate

图2乙酰化二淀粉己二酸酯添加量对豆浆体系黏度的影响Fig.2Effect of acetylated distarch adipate concentration on soy milk viscosity

蛋白质与多糖溶液具有相容性时，随着多糖添加量的增加，体系的黏度会增大；温度降低时体系的黏度也增大，且总体黏度大于多糖单独存在时的黏度；但是两者不相容时，情况相反。图1、2分别为乙酰化二淀粉己二酸酯以及添加乙酰化二淀粉己二酸酯的豆浆在30、80℃条件下恒温水浴加热20min后的黏度。乙酰化二淀粉己二酸酯溶液的黏度随着其质量浓度的增加而增大，且温度降低时黏度增大。与豆浆混合后，体系黏度随着乙酰化二淀粉己二酸酯添加量的增加、温度降低而增大，且混合后黏度高于单纯的乙酰化二淀粉己二酸酯溶液，表明乙酰化二淀粉己二酸酯与豆浆体系具有一定的相容性。

2.1.2玻璃化转变温度法测定乙酰化二淀粉己二酸酯与豆浆体系相容性

在食品体系中，各组分的相容性在复合中起到重要作用，对组分的相容性可采用热分析法如DSC测定玻璃化转变温度（Tg）来评价。Jagannath等［12］采用热分析的方法证明明胶和淀粉在热混合时只有一个Tg，表明组分间具有较好的相容性。田华锋［13］通过DSC测试含增塑剂的大豆分离蛋白塑料，将增塑剂三乙胺，己二酸二乙酯与大豆蛋白具有良好相容性归结为材料只有一个玻璃化转变温度的原因。

图3不同乙酰化二淀粉己二酸酯添加量条件下的大豆粉DSC曲线DSCFig.3DSC curves of soy milk po wder with different concentrations of acetylated distarch adipate

表1　不同乙酰化二淀粉己二酸酯添加量得到的大豆粉玻璃化转变温度Table 1 Glass-transition temperature of soy milk powder with different concentrations of acetylated distarch adipate

由图3、表1可知，原料大豆的玻璃化只有一个玻璃化转变温度，为-36.1℃，乙酰化二淀粉己二酸酯的玻璃化转变温度为-24.4℃，添加不同量的乙酰化二淀粉己二酸酯后得到的腐竹玻璃化转变温度仍为一个，大小在大豆粉和乙酰化二淀粉己二酸酯之间，因此豆浆与乙酰化二淀粉己二酸酯在pH8.0，加热温度为85℃，加热时间为20min时，形成的腐竹中豆浆成分与乙酰化二淀粉己二酸酯具有较好的相容性。实验结果与黏度法测定豆浆和乙酰化二淀粉己二酸酯相容性的结果一致。

2.2乙酰化二淀粉己二酸酯对豆浆体系静电及氢键作用的影响

图4NaCl（A）、尿素浓度（B）和丙二醇体积分数（C）对豆浆及其与乙酰化二淀粉己二酸酯混合体系黏度的影响Fig.4Effects of NaCl（A），urea（B）and propylene glycol concentration（C）on the viscosity of soy milk added with acetylated distarch adipate

NaCl、尿素及丙二醇是研究物质分子间相互作用力常用的试剂。早在1987年，Bernal［14］就利用食盐、尿素、巯基乙醇等通过破坏分子间作用力来研究阴离子多糖与乳清蛋白、肌原纤维蛋白在混合水溶液中的相互作用情况。

由图4A1、4A2可知，加入NaCl后，豆浆的黏度先下降后上升。随着体系pH值的增加，蛋白质黏度最小时需要的NaCl浓度越高。添加乙酰化二淀粉己二酸酯后，豆浆体系在NaCl的作用下，黏度变化趋势与添加前基本不变。由图4B1、4B2可知，豆浆体系黏度随着尿素浓度的增加呈先增加后降低的趋势。但添加乙酰化二淀粉己二酸酯后，豆浆体系黏度最后趋于稳定。这可能是乙酰化二淀粉己二酸酯对豆浆氢键的保护作用的结果。实验在80℃时与30℃未表现出相同的趋势，可能是较高温度已经使蛋白质变性的原因。由图4C1、4C2可知，随着丙二醇添加量的增加，体系黏度逐渐增加。但是添加乙酰化二淀粉己二酸酯后丙二醇的作用效果减弱，这与张利［15］使用丙二醇研究卵清蛋白-多糖共混凝胶氢键作用结果不同，可能是乙酰化二淀粉己二酸酯的存在阻碍了丙二醇对豆浆蛋白质氢键的作用。因此，乙酰化二淀粉己二酸酯对豆浆复合体系静电作用影响很小，但是具有保护豆浆体系氢键的作用。

2.3乙酰化二淀粉己二酸酯对豆浆体系巯基含量的影响

图5乙酰化二淀粉己二酸酯质量浓度对豆浆巯基含量影响Fig.5Effect of acetylated distarch adipate concentration on sulfydryl content in soy milk

由图5可知，乙酰化二淀粉己二酸酯的添加未对豆浆的巯基含量产生明显的影响。本实验测得豆浆中巯基含量较低，这是因为豆浆中的巯基含量与打浆时的温度及氧气有关［16］，实验时虽然采用冰水打浆，但是料理机打浆时产生了较多热量和大量的气泡，混入空气，造成部分巯基氧化损失。豆浆中巯基含量直接影响着蛋白膜网络结构的致密性，巯基含量高时，网络结构更均匀致密，性能更好。乙酰化二淀粉己二酸酯的加入未能提高豆浆中巯基含量，但是也未使其显著减小。

2.4乙酰化二淀粉己二酸酯对豆浆体系表面疏水性的影响

图6乙酰化二淀粉己二酸酯对豆浆表面疏水性的影响Fig.6Effect of acetylated distarch adipate on soy milk hydrophobicity

在维持蛋白质的三级结构中，最重要的作用力是疏水相互作用［17］。作为一种大分子结构，表面疏水性影响着分子之间的相互作用情况，具有显著影响。由图6可知，添加5g/100g乙酰化二淀粉己二酸酯后，豆浆表面疏水性随着加热时间的延长而增大，且整个实验过程中，豆浆的表面疏水性均大于无乙酰化二淀粉己二酸酯添加的空白对照组。随着加热时间的延长豆浆表面疏水性增大，可能是加热使豆浆蛋白质表面伸展、疏水基团暴露的结果，加入乙酰化二淀粉己二酸酯后，疏水性进一步加大可能是由于乙酰化二淀粉己二酸酯分子质量大，本身结构的空间排阻效应又使暴露的疏水性氨基酸无法聚集［18］，因此乙酰化二淀粉己二酸酯的加入能增大豆浆表面疏水性。

2.5乙酰化二淀粉己二酸酯对豆浆体系乳化性的影响

图7乙酰化二淀粉己二酸酯质量浓度对豆浆乳化力及乳化稳定性影响Fig.7Effect of acetylated distarch adipate concentration on the emuls ifying capacity and emulsion stability of soy milk

在一定条件下，单位数量的蛋白质能乳化一定量的油脂，形成水包油乳化体系，当油脂的总量太大时，水包油乳化体系会遭到破坏并且发生相的转化，油脂由分散相转化为连续相，而水由连续相转化为分散相，形成油包水的乳化体系［19］。由图7可知，随着乙酰化二淀粉己二酸酯添加量的增加，豆浆的乳化力及稳定性都逐渐增大，变性淀粉对豆浆乳化性的影响，可能是与乙酰化二淀粉己二酸酯本身的性质有关，作为一种交联酯化淀粉，乙酰化二淀粉己二酸酯是淀粉经过乙二酸和醋酸酐交联酯化而得到，引入的乙酰基和交联键使淀粉分子形成较大的网络结构，组成合理的亲水-疏水结构，具有一定的乳化性作用。对于类似高分子乳化剂的表面活性剂，因为它们的分子质量很大，无法在界面整齐排列，虽然对界面张力的降低不多，但是它们可以被吸附到油-水界面上，增加亲和力，从而乳状液的稳定性［20］。同时乙酰化二淀粉己二酸酯作为一种常用的增稠剂，使体系黏度变大，因此能在一定程度上提高豆浆的乳化力及稳定性。

2.6乙酰化二淀粉己二酸酯对豆浆体系分子质量及表面微观情况的影响

2.6.1腐竹分子质量变化

由图8可知，大豆蛋白的主要成分7S（分子质量：180～210kD）及11S（分子质量：350～370kD）在添加不同量的乙酰化二淀粉己二酸酯前后得到的腐竹没有发生显著差别。乙酰化二淀粉己二酸酯添加量较少（0～3g/100g干豆）时腐竹电泳条带比大豆粉更深，表明此时的腐竹蛋白质含量更高，添加量为9g/100g干豆时腐竹电泳条带与大豆粉基本相似，当添加量为15g/100g干豆时，条带比大豆粉略浅，这与添加乙酰化二淀粉己二酸酯后腐竹蛋白质含量的变化趋势相同，此外大豆蛋白亚基条带随着变性淀粉添加量的变化基本不变。实验结果表明在腐竹揭膜过程中乙酰化二淀粉己二酸酯的加入并未与大豆中的成分发生引起分子质量显著变化的反应。

图8腐竹SDS-PAGE结果AGEFig.8Electrophoresis of proteins from yuba made with different amounts of acetylated distarch adipate

2.6.2腐竹的表面微观结构变化

扫描电镜不仅可以观察到膜表面的微观结构，还可用于辅助判断共混膜组分之间的相容性。Wu Ronglan等［21］通过观察纤维素与大豆分离蛋白共混膜的表面结构，说明纤维素与蛋白质之间良好的相容性。Wang Qun等［22］通过扫描电镜观察海藻酸/大豆蛋白共混纤维的形貌，把蛋白质和海藻酸之间的共混均一性和高度的相容性归结为共混膜表面结构致密均一的原因。本实验对腐竹进行干燥后，使用扫描电子显微镜观察的结果见图9。

图9不同乙酰化二淀粉己二酸酯添加量腐竹的扫描电镜结果Fig.9SEM images of yuba made with different amounts of acetylated distarch adipate

对未添加乙酰化二淀粉己二酸酯的腐竹，表面粗糙不均匀，添加量为3～6g/100g干豆时，腐竹表面比优化腐竹表面更光滑致密，但是当添加量为9～15g/100g时，腐竹表面开始出现明显的不溶物，镶嵌在腐竹表面。这可能是由于在腐竹成膜过程中，加热及其他变性处理使蛋白质变性，形成立体的网络结构，这个网络结构中含有较多空隙，少量的乙酰化二淀粉己二酸酯能很好地进入膜的空隙，将蛋白膜的网络空间填满，使膜的致密性增加，从而提高膜的机械性能。而变性淀粉过多时只能附着在膜表面。对9g/100g添加量时的腐竹表面微观结构（图10）进行放大观察可知，乙酰化二淀粉己二酸酯主要是以镶嵌的方式存在腐竹膜上。

图1　0乙酰化二淀粉己二酸酯添加量为9g/100g腐竹的微观结构（×5000）000Fig.10Microstructure of yuba made with acetylated distarch adipate at a level of9g/100g of dried soybean（×5000）

3　结论

在腐竹揭膜中加入乙酰化二淀粉己二酸酯，是以镶嵌的方式作用于腐竹膜。在揭膜过程中乙酰化二淀粉己二酸酯可填充蛋白质变性形成的网络结构中的空隙，增加腐竹的致密性，从而使腐竹膜的机械性能提高，得率增加。从分子角度分析认为可能是添加乙酰化二淀粉己二酸酯后，使大豆蛋白质分子氢键、表面疏水性及乳化能力增强的结果。

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Interaction Mechanism between Acetylated Distarch Adipate and Soymilk on Yuba Membrane

XIE Liyan，LIN Ying*，WU Heng，XU Xiaohui，ZHU Xueqiong
（Institute of Light Industry and Food Engineering，Guangxi University，Nanning530004，China）

The mechanisms of interaction between acetylated distarch adipate and soymilk on yuba membrane were investigated using differential scanning calorimeter，fluorospectro photometer and scanning electron microscope.The results showed that during dyestripping，the acetylated distarch adipate was inlayed in the interspaces of the network structure when the protein was denaturized，resulting in more compacted protein film and accordingly increased yuba yield with improved mechanical capacity.Therefore，the addition of acetylated distarch adipate can enhance the hydrogen bond，surface hydrophobicity and emulsifying capacity of soybean proteins.

acetylated distarch adipate；yuba；mechanism；fluorospectro photometer；scanning electron microscope

TS214.2

A

1002-6630（2015）05-0077-06

10.7506/spkx1002-6630-201505015

2014-04-07

谢丽燕（1987—），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：e529322926@163.com

林莹（1971—），女，教授，博士，研究方向为食品加工与质量安全。E-mail：ly9a9@126.com