天灸防治大鼠肝纤维化的实验研究

刘文吉,李胜杰,罗钦,冀美琦,张伟,解秸萍



天灸防治大鼠肝纤维化的实验研究

刘文吉,李胜杰,罗钦,冀美琦,张伟,解秸萍

(北京中医药大学,北京 100029)

目的 观察天灸防治大鼠肝纤维化(HF)的作用。方法 将30只大鼠随机分为治疗组、模型组和对照组,每组10只。采用四氯化碳腹腔注射造模的方法建立HF大鼠模型,治疗组从造模后第3星期开始进行天灸治疗,每星期2次,每次6 h,共治疗4星期。观察各组大鼠体重、肝湿重、肝指数,比较血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及血清和肝脏Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、IV型胶原(IV-C)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)的含量。结果 模型组大鼠HF程度分级及HF组织胶原分析指标与治疗组和对照组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。模型组大鼠体重、肝湿重及肝指数与对照组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。治疗组大鼠肝湿重和肝指数与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。模型组大鼠血清ALT、AST含量及血清及肝脏PCIII、IV-C、HA、LN含量与对照组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。治疗组大鼠血清ALT、AST含量及血清及肝脏IV-C、HA、LN含量与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。治疗组大鼠血清PCⅢ含量与模型组比较,差异具有统计学意义(＜0.01)。结论 天灸具有一定的防治大鼠肝纤维化的作用。

穴位贴敷法;发泡疗法;肝纤维化;大鼠

肝纤维化(HF)是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生,导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。各种病因引起的慢性肝病都可能继发纤维化,逐步发展为肝硬化等不良严重后果。近年来,针对此疾病的中西疗法已较为明确,但疗程较长所带来的药物毒副反应以及针灸患者的依从性较差都是亟待解决的问题。天灸采用刺激性药物敷贴于皮肤表面,致使局部充血发泡,激发经络气血运行,起到调整机体免疫的作用。本实验通过建立HF模型,观察天灸对HF大鼠的防治作用,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF级雄性SD大鼠30只,体重为200～220 g,由斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供[合格号SCXK(京)2011-0004]。随机分为治疗组、模型组和对照组,每组10只。所有大鼠均按国家标准固体混合饲料喂养,自由饮食。实验室温度为18 ℃～22 ℃,相对湿度为50%～60%。

1.2 仪器与试剂

7160型全自动生化分析仪(日本日立公司);美国Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件;放免试剂盒(北京华英生物技术研究所提供);CCL4分析纯(国药集团化学试剂有限公司提供);橄榄油分析纯(国药集团化学试剂有限公司提供);斑蝥(东直门医院提供)。

1.3 模型制备

治疗组和模型组大鼠普通饲料适应性饲养3 d后,参考邵佳亮等[1]造模方法制备HF大鼠模型,即大鼠按0.3 mL/100 g腹腔注射40%四氯化碳(CCL4)橄榄油溶液,每星期2次,连续6星期。

1.4 实验动物处理

各组均给予普通饲料,自由饮水。

治疗组造模后第3星期进行天灸治疗。取肝俞、期门穴。将斑蝥粉碎后,过80目筛,装入瓶中备用。在直径为22 mm且内含10 mm×10 mm吸水垫的穴位贴上,取提前预备好的斑蝥粉,每穴0.05 g[2],用清水调至膏状后放在吸水垫中央,贴敷穴位,贴敷时间为6 h[2]。每星期治疗2次,共治疗4星期。

模型组和对照组大鼠均抓取束缚,每次6 h,每星期2次,共治疗6星期。

1.5 标本采集

大鼠断头取血5～8 mL,离心(4℃,3000 rpm, 10 min)后取上清液,-80℃保存;取肝脏,称湿重后迅速取两块约300 mg肝左叶相同部位组织,一份置10%甲醛溶液中固定,分别用HE 染色和 Masson 法胶原纤维染色;另一份肝组织与PBS缓冲液按1:4比例置于匀浆器中研磨,离心(4℃,3000 rpm,15 min)后取上清液,-80℃保存。

1.6 观察指标

1.6.1 血清学检测

全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST);放射免疫法检测血清和肝脏匀浆液III型前胶原(PCⅢ)、IV型胶原(IV-C)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)的含量,具体检测方法见试剂盒说明书。

1.6.2 组织学检查

肝脏组织常规石蜡切片,分别采用HE染色和Masson染色,在光镜下观察肝脏炎症坏死程度及胶原分布情况。

1.6.2.1 HE染色

肝炎病变依纤维化程度分为0～4期[3]。0期为汇管区及小叶内无纤维化;1期为汇管区纤维化扩大,限局窦周及小叶内纤维化;2期为汇管区周围纤维化,纤维间隔形成,小叶结构保留;3期为纤维间隔伴小叶结构紊乱,无肝硬化;4期为早期肝硬化。

1.6.2.2 MASSON染色

胶原分布情况按肝纤维化半定量方法(SSS)[4]进行纤维化计分和美国IPP专业图像分析软件进行定量分析,具体操作为,病理片在显微镜下放大10×10倍,于标本四角和中央位置选取5个视野,测定每1个视野中胶原纤维含量,以纤维占视野面积的百分比表示,取平均值[5]。

1.7 统计学方法

实验数据用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。若数据呈正态性分布,方差齐用单因素ANOVA方差分析(检验),法进行两两比较,方差不齐用Welch (检验),检验进行两两比较,正态分布数据以均数±标准差表示;若数据是非正态分布,用秩和检验,用两个独立非参进行两两比较,数据以)表示。

2 结果

2.1 各组大鼠HF程度分级比较

对照组HE染色光镜下示肝小叶结构完整,肝细胞索排列规则有序,肝细胞间连接紧密,呈放射状分布,肝窦与汇管区无成纤维细胞。模型组肝细胞索排列紊乱,纤维结缔组织增生形成条状纤维间隔,可见假小叶形成,肝纤维化病理分期80%在2～3期,与对照组比较,差异具有统计学意义(＜0.01)。治疗组可见汇管区纤维结缔组织增生及纤维间隔形成均较模型组少,肝纤维化病理分期30%在2～3期,与模型组比较,差异具有统计学意义(＜0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠HF程度分级比较 (n)

注:与对照组比较1)＜0.01

2.2 各组大鼠HF组织胶原分析指标比较

对照组Masson染色可见肝小叶结构清晰,中央静脉及肝窦内汇管区少量胶原纤维分布;模型组可见汇管区和小叶间有大量增生的粗大胶原纤维,有大量大小不等的假小叶形成,半定量评分与图像分析与对照组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。治疗组见中央静脉星芒状增厚,汇管区纤维间隔形成,假小叶形成较少,半定量评分和图像分析与模型组与对照组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠HF组织胶原分析指标比较 (±s)

表2 各组大鼠HF组织胶原分析指标比较 (±s)

组别n 半定量评分(分)图像分析(%) 治疗组7 9.91±1.172)16.82±3.962) 模型组715.84±3.621)29.55±4.131) 对照组70.00±0.000.65±0.37

注:与对照组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.05

2.3 各组大鼠体重、肝湿重、肝指数比较

各组大鼠体重均有所增长,模型组大鼠体重明显低于对照组,差异具有统计学意义(＜0.01)。治疗组体重低于模型组,有下降趋势(P＞0.05)。模型组大鼠肝湿重和肝指数均明显增加,与对照组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。治疗组大鼠肝湿重和肝指数与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。详见表3。

表3 各组大鼠体重、肝湿重、肝指数比较 (±s)

表3 各组大鼠体重、肝湿重、肝指数比较 (±s)

组别n体重(g)肝湿重(g)肝指数(%) 治疗组7321.85±6.7010.67±0.392)3.29±0.742) 模型组7337.71±6.781)12.68±0.571)3.75±0.131) 对照组7371.86±9.358.92±0.452.39±0.68

注:与对照组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

2.4 各组大鼠血清ALT、AST含量比较

模型组大鼠血清ALT、AST含量较对照组明显升高,差异均有统计学意义(＜0.01)。治疗组血清ALT、AST含量均低于模型组,差异均有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠血清ALT、AST含量比较 (±s,IU/L)

表4 各组大鼠血清ALT、AST含量比较 (±s,IU/L)

组别n ASTALT 治疗组7 170.14±4.832)58.43±4.593) 模型组7 204.51±4.251) 84.36±10.191) 对照组790.80±6.9637.92±3.82

注:与对照组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01,3)＜0.05

2.5 各组大鼠血清及肝脏HA、PCⅢ、IV-C、LN含量比较

模型组大鼠血清及肝脏PCⅢ、IV-C、HA、LN含量均显著高于对照组,差异均具有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。治疗组大鼠血清PCⅢ、IV-C、HA、LN含量均显著下降,与模型组比较,差异均具有统计学意义 (＜0.01,＜0.05)。治疗组大鼠肝脏IV-C、HA、LN含量也显著下降,与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。详见表5。

表5 各组大鼠血清及肝脏HA、PCⅢ、IV-C、LN含量比较 (±s,ng/mL)

表5 各组大鼠血清及肝脏HA、PCⅢ、IV-C、LN含量比较 (±s,ng/mL)

组别n 类型PCⅢIV-CHALN 治疗组7 血清105.75±1.303)118.17±6.564) 112.06±4.384)134.06±4.274) 肝脏16.55±0.64 12.30±1.234) 17.99±0.493) 17.51±0.754) 模型组7 血清109.96±0.791)138.95±6.131) 124.08±3.481)148.14±2.891) 肝脏 18.29±0.691)13.91±1.172) 22.63±0.501) 20.13±0.622) 对照组7 血清95.69±0.5682.03±2.83 83.85±3.59106.28±6.18 肝脏14.15±0.488.81±0.69 11.25±1.57 17.35±0.96

注:与对照组比较1)＜0.01,2)＜0.05;与模型组比较3)＜0.01,4)＜0.05

3 讨论

根据慢性肝炎及肝硬化的临床表现,中医学认为HF与“瘕积”有一定的类同之处,其病机主要为本虚标实、血瘀痰结[6]。治疗中,扶正祛邪是关键。天灸引起局部发泡后产生对穴位的机械、化学、生物刺激作用,激发穴位经络之气传至脏腑,达到协调阴阳、调整气血,扶正祛邪的作用。本实验中,选取肝俞、期门是因其对肝脏具有相对特异性。肝主疏泻,又主藏血,肝之背俞穴肝之经气输注于背部之处,有疏肝利胆,活血化瘀之功。期门穴为肝之募穴,输布于全身的气血由此入肝。肝俞与期门相配为俞墓配伍,前后同治,起到治疗肝脏疾病的作用。现代研究[7]显示,大多数俞、募穴与相应脏腑属于同神经节段。过往研究可见,针灸肝俞、期门及其他配穴,可有效改善肝脏功能,引起血清中ALT、AST下降及血清PCⅢ、IV-C、HA、LN下降[8]。

天灸作用于体表,通过具有引赤发泡作用的药物贴于穴位皮肤上,起到一种微面积的化学性、烧伤性刺激作用。这种刺激首先作用在皮肤的神经感受器上,对机体的有关物理、化学感受器产生影响,直接反射性地调整大脑皮层和植物神经系统的功能,提高机体免疫功能,达到治疗疾病的目的[9-12]。有研究[13-16]显示,天灸疗法能促进机体免疫细胞的生成和提高免疫细胞的活性。过往研究显示,自然杀伤细胞(NK)[17]、T细胞亚群(NKT)[18]、巨噬细胞[19]等细胞通过合成分泌细胞因子、趋化因子等化学介质,构成影响肝星状细胞(HSC)的免疫细胞-细胞因子-趋化因子免疫微环境,而HSC是肝脏内合成ECM的主要细胞,HSC的活化和增值被认为是HF发生的中心环节[20]。

另一方面,天灸药物可使皮肤发生无菌性渗出性炎症反应,继而引起局部皮肤细胞膜蛋白质可逆性结构变化,形成疏松组织,增加皮肤渗透性,从而增加药物有效成分的渗入。本实验使用之斑蝥,经现代药理实验[21]证明其主要成分为斑蝥素及结合斑蝥素如去甲斑蝥素、斑蝥酸钠等,具有破瘀散结、攻毒蚀疱、抗纤维化、抗肿瘤等作用[22-25]。过往研究[26]显示,去甲斑蝥素可以抑制活化的 HSCs增殖,并通过降低线粒体膜电位,激活 Caspase3 酶的活性促进 HSCs凋亡,抑制细胞周期使细胞生长阻滞于G2/M期,改善肝纤维化程度。另有研究[27]显示,斑蝥酸钠可以明显降低转氨酶和患者肝纤维化血清标志物(PCⅢ、IV-C、HA、LN)。而现代研究[28]发现,斑蝥酊剂引起皮肤水泡的发泡液中含有中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞及IL-12等免疫物质,证明了斑蝥天灸可以提高患者免疫能力。

本实验结果表明,经四氯化碳(CCL4)腹腔注射造模后,模型组的肝湿重和肝指数、血清中AST、ALT以及血清和肝脏HA、PCⅢ、IV-C、LN水平明显高于对照组,表明造模成功。经数星期治疗后,治疗组肝湿重和肝指数、血清中AST和ALT以及血清和肝脏HA、PCⅢ、IV-C、LN水平较模型组有明显下降,且肝脏病理片有明显改善,提示应用斑蝥天灸肝俞、期门穴治疗是有效的。这可能与肝俞、期门与肝属于同神经节段,天灸产生的机械刺激可以发挥其经络调节作用有关;亦或与天灸产生的化学刺激激发机体免疫有关。另外,斑蝥中的药用成分也起到了不容忽视的作用,这可能与去甲斑蝥素通过抑制活化的HSCs增值和促进其凋亡实现抗HF的作用有关,而斑蝥素纳也可溶解吸收肝内胶原纤维,改善HF。但由于实验周期较短、检测指标较少,未能深入论述斑蝥天灸防治HF的机制机理,有待于在今后的研究中深入完善。

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Experimental Study of Vesiculation Moxibustion for Prevention and Treatment of Rat Hepatic Fibrosis

LIU Wen-ji, LI Sheng-jie, LUO Qin, JI Mei-qi, ZHANG Wei, XIE Jie-ping.

Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100029, China

Objective To investigate the preventive and therapeutic effects of vesiculation moxibustion on rat hepatic fibrosis (HF). Methods Thirty rats were randomly allocated to treatment, model and control groups, 10 rats each. A rat model of HF was made by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride. At three weeks after model making, the treatment group was treated by vesiculation moxibustion 6 hrs twice a week, for a total of 4 weeks. Body weight, liver wet weight, liver index, serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) contents, and serum and liver type Ⅲ procollagen (PC Ⅲ), type Ⅳ collagen (Ⅳ-C), hyaluronic acid (HA) and laminin (LN) contents were measured in every group of rats. Results There were statistically significant differences in HF severity grade and HF tissue collagen analysis indices between the model group of rats and the treatment group or the control group (＜0.01,＜0.05). There were statistically significant differences in body weight, liver wet weight and liver index between the model and control groups of rats (＜0.01). There were statistically significant differences in liver wet weight and liver index between the treatment and model groups of rats (＜0.01). There were statistically significant differences in serum ALT and AST contents, and serum and liver PC Ⅲ, Ⅳ-C, HA and LN contents between the model and control groups of rats (＜0.01,＜0.05). There were statistically significant differences in serum ALT and AST contents, and serum and liver Ⅳ-C, HA and LN contents between the treatment and model groups of rats (＜0.01,＜0.05). There was a statistically significant difference in serum PC Ⅲ content between the treatment and model groups of rats (＜0.01). Conclusion Vesiculation moxibustion has some preventive and therapeutic effects on rat hepatic fibrosis.

Acupoint application; Vesiculation therapy; Hepatic fibrosis; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.05.0460

2014-10-12

1005-0957(2015)05-0460-04

刘文吉(1988 - ),女,2012级硕士生

解秸萍(1961 - ),女,教授,E-mail:xiejieping@sina.com