长春地区598例乙型肝炎病毒基因分型及耐药变异分析

刘淑荣　黄显娇　赵文静等

[摘要] 目的 研究长春地区598例乙型肝炎患者乙型肝炎病毒（hepatitis B virus）基因分型及耐药基因突变情况。方法 收集598例HBVDNA高于检测下限（>1000拷贝/mL）乙型肝炎患者血清，PCR反向点杂交法检测HBV基因型和耐药变异位点。 结果 598例样本中， B基因型35例（5.85%）， C基因型525例（87.79%），BC混合基因型32例（5.35%），D基因型2例（0.33%），未分型4例（0.67%）。79例发生HBV耐药变异，总体变异率为13.21% ，其中B基因型3例（3.80%），C基因型73例（92.41%），BC混合基因型2例（2.53%），未分型1例（1.27%）； rtM204检出率最高75.94%（60/79）， rtM204变异位点耐药突变模式有10种类型。 结论 长春地区HBV感染患者基因型以C基因型为主，HBV基因耐药以rtM204位点检出率最高，变异模式复杂。

[关键词]乙型肝炎；HBV基因分型；基因耐药；PCR反向点杂交法

[中图分类号] R446.61 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）15-12-03

[Abstract] Objective To investigate Hepatitis B virus genotype and drug-resistant mutation patterns in 598 patients with hepatitis B in Changchun region. Methods Serum of a total 598 patients with hepatitis B whose HBVDNA was higher than the lower limit of detection （more than 1000copies/mL） were collected. To detect HBV genotype and drug-resistance site mutation by PCR reverse dot blot hybridization method. Results Of the 598 serum samples， there were 35 samples（5.85%） of genotype B， 525 samples（87.79%） of genotype C， 32 samples（5.35%） of B and C mixed genotype， 2 samples（0.33%） of genotype D and 4 samples（0.67%） of undifferentiated type. Drug-resistant mutation were detected in 79 samples， accounting for 13.21%， which included 3 samples（3.80%） of genotype B， 73 samples（92.41%） of genotype C， 2 samples（2.53%） of B and C mixed genotype and 1 case（1.27%） of undifferentiated type. The most frequently detection rate of rtM204 mutation was 75.94%（60/79）. There were 10 types of patterns in rtM204 site mutation. Conclusion The main HBV genotype is genotype C in patients infected by HBV in Changchun region， and the detection rate of rtM204 site mutation is the highest among all the drug-resistance site mutations detected in patients with hepatitis B， what's more the mutation patterns are complicated.

[Key words] Hepatitis B； HBV genotype； Drug-resistance mutation； PCR combined reverse dot blot method

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性的公共卫生问题，我国约有9300万HBV感染者，其中慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者约2000万例，每年约有30万人死于HBV感染所指的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌[1-2]。根据HBV全基因核苷酸序列的异质性将HBV分为A-H共8种基因型，HBV基因型具有明显的地域差异，同时不同基因型与病情的严重程度、预后、抗病毒治疗效果等方面都可能有一定的相关性[3-5]。核苷（酸）类似物[nucleos（t）ide analogue，NAs]起效迅速、服用方便、副作用小，是目前临床治疗慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的重要药物，随着NAs的长期使用HBV发生耐药的危险性也随之增加，HBV耐药变异是引起NAs 抗病毒治疗失败的最重要的原因[6-10]。本研究采用PCR反向点杂交法检测长春地区598例HBV感染患者的HBV基因型及常见的8个耐药位点变异情况，了解本地区HBV基因型分布特征和HBV耐药变异位点突变模式，为乙型肝炎患者抗病毒治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 血清标本

采集2013年1月～ 2014年1月吉林省肝胆病医院门诊和住院乙型肝炎患者，筛选出HBVDNA高于检测下限（>1000拷贝/mL）患者598例，其中男448例，女150例，年龄15 ～ 76岁。病例诊断均符合2010版中国《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准[11]，排除合并甲、丙、戊和庚型肝炎病毒感染，血清标本-80℃保存备检。

1.2 HBV感染血清学标志物和HBVDNA测定

患者血清HBV感染标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb 、HBcAb采用罗氏试剂在罗氏7100电化学发光仪测定（Roche Diagnose，中国上海）；HBVDNA采用中山达安基因有限公司试剂在美国ABI荧光定量PCR扩增仪测定。

1.3 HBV基因分型和耐药检测

采用深圳亚能生物技术有限公司生产HBV分型和耐药突变基因检测试剂盒，可检测HBV B＼C＼D基因型以及常见核苷（酸）类似物耐药相关的8个耐药位点，包括：rt180、rt184、rt204、rt202、rt207、rt181、rt236、rt250。

1.4 HBV基因型和耐药性检测方法

严格按试剂盒说明书进行操作，主要操作流程如下：（1）离心柱提取方法提取血清HBVDNA；（2）DNA为模板进行HBVDNA 的PCR扩增；（3）恒温杂交箱47℃杂交1.5h；（4）洗膜；（5）孵育；（6）显色：将膜条浸泡与显色液中避光显色15min，观察结果。

2 结果

2.1 患者基本临床资料

598例乙型肝炎患者中，急性肝炎25例，慢性乙型肝炎313例，肝癌58例，肝硬化202例， 均为HBsAg阳性，其中HBe Ag阳性358例，HBe Ag阴性240例，HBVDNA定量检测显示Log10 HBVDNA（5.36±2.24）copies/mL。

2.2 HBV基因分型检测结果

598例乙型肝炎患者HBV基因分型检测结果：B基因型5.85%（35/598），C基因型87.79%（525/598），BC混合基因型HBV感染者占5.35%（32/528），D基因型0.33%（2/598），未分型4例占0.67%（4/598）。313例慢性乙型肝炎患者B基因型6.07%（19/313）， C基因型89.45%（280/313），BC混合基因型3.51%（11/313），D基因型0.32%（1/313），未分型0.63%（2/313）。

2.3 HBV耐药变异检测结果

在598例患者中检出79例发生HBV耐药变异，总体变异率为13.21%（79/598），其中B基因型3例（3.80%，3/79），C基因型73例（92.41%，73/79），BC混合基因型2例（2.53%，2/79），未分型1例（1.27%，1/79）。检出相关耐药突变位点有rtL180M、rtT184A/L、rtM204I/V、rtS202G、rtM/V207I、rtA181V/T、rtN236T、rtM250V/L。8个HBV相关耐药突变位点检出率各不相同， rtM204检出率最高75.94%（60/79），其余位点检出率分别为rtL180（38/79），rtA181（18/79）， rtN236（9/79）， rtT184（3/79）， rtS202（1/79）， rtM250（1/79）， rtM/V207（1/79）。

进一步分析对60例rtM204位点变异情况，rtM204位点有10种突变模式，2种rtM204单一位点变异和8种与其他耐药位点联合突变模式，结果见表1。

3 讨论

在中国主要以B基因型和C基因型为主，其中北方以C基因型为主，南方以B基因型为主[12]。本研究采用PCR反向点杂交法检测长春地区598乙型肝炎患者HBV基因型，检测出B基因型5.85%（35/598）， C基因型87.79%（525/598），基因BC混合型5.35 %（32/528），0.33%（2/598），未分型4例占0.67%（4/598），其中313例慢性乙型肝炎患者B基因型6.07%（19/313）， C基因型89.45%（280/313），BC混合基因型3.51%（11/313），D基因型0.32%（1/313），未分型0.63%（2/313），研究结果表明长春地区HBV感染者以C基因型为主，B基因型和BC混合型较少，此研究结果符合我国北方HBV基因型地理分布特点。

目前治疗CHB的核苷（酸）类药物主要有拉米夫定（LAM），阿德福韦酯（ADV），恩替卡韦（ETV）和替比夫定（LdT），在应用NAs长期抗病毒治疗过程中，耐药是非常重要的问题，一旦发生耐药，不仅影响抗病毒治疗效果，增加后续治疗的难度，甚至可导致疾病进展，增加发生肝功能失代偿的风险。在抗病毒治疗过程中检测HBV耐药位点检测，确定HBD耐药基因突变模式，合理选择抗病毒药物及确定治疗方案。本研究主要对临床常用的四种核苷（酸）类药物相关的8种耐药基因进行检测。在598例乙型肝炎患者中检出79例有HBV耐药变异，总体变异率为13.21%（79/598），79例耐药变异中8个位点上的耐药变异检出率各不相同， rtM204检出率最高75.94%（60/79），rtM204I/V位点变异主要与LAM和LDT耐药相关，rtM204检出率高可能有二方面的原因，一是LAM和LDT 为低耐药基因屏障药物，另一方面可能与LAM在我国上市最早、使用时间最长，应用患者较多有关[13-14]。

本研究对60例发生rtM204位点变异进行了分析，结果显示rtM204位点有10种突变模式，2种rtM204单一位点变异和8种与其它耐药位点联合突变模式。rtM204I/V耐药通路与LAM和LdT耐药及ETV耐药进化相关[15]，仅需出现rtM204原发耐药位点突变位点即可导致LAM和LDT耐药，同时rtM204I/V位点变异可以促进发生ETN耐药，在现有的可供选择的抗病毒药物中，一旦发生rtM204I/V变异，后续抗病毒治疗的难度明显增加。Tenney等[16]的研究表明rtM204V与rtL180M联合变异病毒株更易发生与ETV耐药相关rt184、rt202和rt250位点突变， 在临床治疗中对已发生rtM204V与rtL180M联合突变的疗效不佳CHB患者加用或换用ETV抗病毒治疗时，必须密切注意患者的病情变化。

综上所述，本研究通过检测了598例HBV感染患者的HBV基因型及常见的8个耐药位点变异情况，长春地区HBV感染患者以C基因型为主，B型和BC混合型较少，同时观察到乙型肝炎患者HBV基因耐药的变异类型和变异模式日趋复杂，在长期抗病毒治疗过程中，进行HBV基因耐药检测，对于正确选择抗病毒药物及合理选择治疗方案具有重要的参考价值。

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（收稿日期：2015-03-12）