葛根芩连汤对高脂饲料饲喂的大鼠非酒精性脂肪性肝炎的实验研究

宋红梅　曲岩　李绍民等

[摘要] 目的 研究葛根芩连汤对大鼠NASH模型的药效学作用。 方法 随机将SD大鼠分为空白组、模型组、葛根芩连汤低剂量组、葛根芩连汤高剂量组，每组10只，然后建立大鼠NASH模型，造模同时进行药物干预；实验第8周结束后进行血清ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C、TNF-α、IL-6、IL-10及肝组织TNF-α、IL-6、IL-10的测定。 结果 （1）肝脏酶学：血清ALT、AST水平，模型组高于空白组（P<0.01），葛根芩连汤高、低剂量组低于模型组（P<0.05）。（2）血脂及肝脂：与空白组相比，模型组血清HDL-C显著降低，血清LDL-C、TG、TC明显增加（P<0.01）。葛根芩连汤高、低剂量组血清HDL-C水平与模型组相比增加，血清LDL-C、TG、TC均降低（P<0.05）。（3）血清及肝组织IL-6、IL-10、TNF-α水平：与空白组相比，模型组血清及肝组织IL-10显著降低，血清IL-6、TNF-α明显增加（P<0.01）。与模型组相比，葛根芩连汤高、低剂量组可明显增加血清及肝组织IL-10含量，降低血清及肝组织IL-6、TNF-α水平（P<0.05）。 结论 葛根芩连汤高、低剂量均能够降低高脂饮食饲喂诱导的NASH大鼠血清转氨酶水平、改善血脂代谢紊乱；能够通过提高抑炎因子和抑制促炎因子两方面调控炎症的发展。

[关键词] 葛根芩连汤；大鼠NASH模型；药效学

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）15-19-04

[Abstract] Objective To study the pharmacodynamic effects of Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction in rats NASH model. Methods To randomly divide the SD rats with blank group， model group， Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction low dose group， Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction high dose group， with 10 rats in each group， then to establish rats NASH model， to build rats model meanwhile to carry out drug intervention. 8th weeks after completion of experiment， to mensurate the serum ALT， AST， TG， TC， HDL-C， LDL-C， TNF-α， IL-6， IL-10， and the hepatic tissue TNF-α， IL-6， IL-10. Results （1） Liver enzymology： The level of serum ALT and AST in model group were higher than which in blank group（P<0.01）， while which in Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction high dose group were lower than which in Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction low dose group（P<0.05）. （2） Blood lipid and liver lipid： Compared with blank group， the level of serum HDL-C was significantly lower in model group， and the serum LDL-C， TG， TC were obviously increased in model group（P<0.01）. Compared with model group， the level of serum HDL-C in Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction high and low dose group were obviously increased， the serum LDL-C， TG， TC in Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction high and low dose group were obviously reduced（P<0.05）. （3） Serum and hepatic tissue IL-6， IL-10， TNF-α level： Compared with blank group， serum and hepatic tissue IL-10 in model group was significantly decreased， serum IL-6， TNF-α in model group were obviously increased（P<0.01）. Compared with model group， serum and hepatic tissue IL-10 in Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction high and low dose group was obviously increased， while serum and hepatic tissue IL-6， TNF-α were lower（P<0.05）. Conclusion Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction high and low dose all could reduce the level of serum transaminase in NASH rats which was induced by the feeding of high fat diet， could improve the metabolism disorder of lipid， could regulate the development of inflammation through to improve anti-inflammatory cytokine and to inhibit promotion inflammation cytokine.endprint

[Key words] Puerariae and Scutellariae and Coptidis Decoction； Rats NASH model； Pharmacodynamic

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种与代谢相关的应激性肝损伤，主要特征是甘油三酯（TG）蓄积，包括单纯性脂肪肝（NAFL）、脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化（NAFC）。研究表明，NAFLD已成为无症状性转氨酶升高的首要原因[1-3]，同时又是肥胖、胰岛素抵抗、高脂血症等代谢综合征相关组分在肝脏的集中体现，严重威胁着人民的身体健康。从NAFL到NAFC的过程中，NASH起着限速的作用，是形成肝硬化的重要原因之一[4-5]。目前研究证实，中医药对NASH的防治具有全方位、多靶点的立体作用，还能针对发病的脂代谢紊乱、胰岛素抵抗[6-7]、氧化应激和脂质过氧化损伤等多个环节的效应指标进行有效调节。现代研究表明，葛根芩连汤具有改善血糖，抗炎，抗氧化的作用。所以本实验选用葛根芩连汤干预高脂饲料诱导的NASH大鼠模型[8]，为开发防治NASH有效的中药制剂提供新思路和实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 4周雄性SD大鼠40只，体重约为（150±200）g，由佳木斯大学动物实验中心提供。

1.1.2 实验中药 处方饮片均购自北京同仁堂制药集团哈尔滨药店，依《伤寒论》生药比例为葛根∶黄连∶黄芩∶炙甘草=8∶3∶3∶2，以该剂量作为低剂量，2倍该剂量为高剂量。用药剂量按实验动物与60kg成人体表面积比等效量核算比率，计算动物的等效剂量。实验时以去纯化水配制成所需浓度，放冰箱保存。

1.1.3 实验饲料 基础饲料及高脂饲料（北京科澳协力饲料有限公司）。

1.1.4 试剂 AST、ALT、TC、TG、HDL-C、LDL-C的全自动生化分析试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）；IL-6、IL-10、TNF-α酶联免疫试剂盒（上海信裕生物科技有限公司）。

1.1.5 主要仪器 7160全自动生化仪（日本日立公司），美国MULTISKAN MK3全自动酶标仪（Thermo），CH-6010组织匀浆机（KINEMATTICA）。其他设备及器具包括：手术器械、离心管、移液管、吸管、试管、烧杯等。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 以高脂饲料连续饲喂8周[9]，自由饮水、摄食，建立NASH大鼠模型。

1.2.2 分组及处置 全部SD大鼠饲喂基础饲料1周后，随机分为4组，每组10只，分别为空白组、模型组、葛根芩连汤低剂量组、葛根芩连汤高剂量组。空白组给予普通饲料，模型组和给药组给予高脂饲料。给药组在饲喂高脂词料的同时分别给予10mL/kg鼠重相应浓度中药灌胃；模型组和空白组按鼠重灌服纯化水。每天固定时间进行一次灌胃，每个组的造模和灌胃同行进行，实施8周结束。

1.2.3 标本采集 实验8周结束全部大鼠取材，取大鼠腹主动脉血及肝组织用于血清学和肝组织相关指标检测。

1.2.4 血清学指标 全自动生化分析仪进行测定血清的相关指标：ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C。酶联免疫法测定血清IL-6、IL-10、TNF-α。

1.2.5 肝组织匀浆上清指标 肝脏IL-6、IL-10、TNF-α水平。在冰水浴中，取肝组织利用超声匀浆机制成匀浆，静置一会，离心后取上清液，按试剂盒说明进行检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS19.0软件，计量资料以（）表示，对实验结果进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝脏酶学

在血清ALT、AST水平检测，模型组显著高于空白组（P<0.01），葛根芩连汤高、低剂量组显著降低于模型组（P<0.05）。见表1。

2.2 血脂

与空白组比较，模型组血清HDL-C水平显著降低，血清LDL-C、TG、TC含量明显增加，差异均具有统计学意义（P<0.01）。葛根芩连汤高、低剂量组血清HDL-C水平与模型组相比增加，血清TG、TC、LDL-C水平下降明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 血清IL-6、IL-10、TNF-α测定

与空白组比较，模型组血清IL-10显著降低，血清IL-6、TNF-α明显增加，差异均有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，葛根芩连汤高、低剂量组在增加血清IL-10、降低血清IL-6、TNF-α方面差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 肝组织匀浆IL-6、IL-10、TNF-α测定

与空白组相比，模型组肝组织匀浆IL-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低，差异均具有统计学意义（P<0.01）；葛根芩连汤高、低剂量组与模型组相比，对肝组织匀浆IL-6、IL-10、TNF-α的改善，差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3 讨论

虽然现代医学对NASH的发病机制及治疗已经进行了大量研究，但由于该病发病的复杂机制及西药作用的单一性使研究受到阻碍，而葛根芩连汤治疗NASH方面鲜有报道。本实验采用高脂饮食诱导的大鼠NASH模型[10-11]，该模型的建立符合人类NASH常见的发病因素，与人类NASH的发病机制也基本相似，能出现以胰岛素抵抗、代谢综合征等为特征的全身代谢紊乱表现，肝脏组织病变具有进行性发展的特点。根据配方的不同，多数可以在4～8周内形成病变程度逐渐加重的NASH模型[12]。现代研究发现，葛根芩连汤可用于治疗2型糖尿病湿热内蕴证，馈荡性结肠炎等疾病[13-15]，具有改善血糖，抗炎，抗氧化的作用。因此，本实验遵循中医学“异病同治”的原则[16]选用葛根芩连汤进行防治NASH的探索性研究。本实验结果显示，在肝细胞损害方面，造模8周后，大鼠模型血清ALT、AST水平显著升高，葛根芩连汤同时干预的各组，血清ALT、AST水平较模型组明显降低，提示葛根芩连汤高、低剂量组同时干预对防治NASH转氨酶升高方面有积极作用；在血脂代谢方面，造模8周后，大鼠模型血清LDL-C、TG、TC含量显著升高，HDL-C显著降低，葛根芩汤同时干预的各组中，葛根芩连汤高、低剂量组血清HDL-C水平与模型组相比明显增加，血清TG、TC、LDL-C水平明显下降，提示葛根芩连汤基本可以达到对NASH脂代谢异常的改善作用[17-19]；在血清及肝组织炎性因子方面，造模8周后，大鼠模型血清及肝组织IL-6、TNF-α含量显著升高，IL-10显著降低。与模型组相比，葛根芩连汤同时干预的各组中，葛根芩连汤高、低剂量组在增加IL-10、降低IL-6、TNF-α方面均差异显著。提示葛根芩连汤在改善炎性因子方面，不仅对NASH引起的肝脏局部炎症有影响，同时能够改善全身血清炎症因子水平，并从抑制促炎因子，提高抑炎因子两方面动态调控炎症的发展。虽然中医药防治NASH的实验研究为临床用药及新药开发提供了更多的实验数据，可以看到中医药多靶点调控疾病发生发展的优势，特别是在调节脂代谢、干细胞损伤、炎症等方面效果显著。然而，其中仍然存在一些问题：目前实验研究所用的动物模型虽然力求在病因、发病机制、组织病理学表现上与人类接近，但仍不能完全符合中医传统的证候学特点，对于中医药的实验研究，仍缺乏病证结合的理想模型，极大影响了中医药防治NASH的研究进展。而且对于实验研究结果缺少细致地思考与分析，普遍停留在重复性认识上，研究结果回归临床的价值少有体现。所以今后的研究应尽可能紧密联系临床实际，对研究结果进行深入地思考分析，必要时可进行重复实验以验证研究结果的可靠性，从而为临床治疗提供科学的实验依据。endprint