基于CCD的胶体金免疫层析检测设备的设计

归 晨 戴 璇 王 侃 崔大祥

(上海交通大学微纳科学技术研究院，上海 200240)

基于CCD的胶体金免疫层析检测设备的设计

归 晨 戴 璇 王 侃 崔大祥*

(上海交通大学微纳科学技术研究院，上海 200240)

研制开发了一套用于细胞毒素相关基因A定量检测的胶体金免疫层析试纸条检测设备。该设备由硬件部分和软件系统两部分组成。硬件系统主要用于胶体金免疫层析试纸条图像的采集，而软件系统则实现了人机的交互。检测设备利用CCD(电荷耦合器件)图像传感器件采集试纸条图像，并传输至PC模块。然后，软件系统利用算法对其进行数据分析和结果诊断。软件系统主要采用了基于HSI色彩空间的移动k-均值图像分割算法，该算法实现了胶体金免疫层析试纸条图像的有效分割，完成了定量检测。本研究用10个不同浓度的胶体金免疫层析试纸条进行检测，绘制出定量曲线。还分别检测了50个阴性和50个阳性的细胞毒素相关基因A实验样品，检测结果显示特异性和灵敏度均为100 %，证明了该设备的可靠性。

免疫层析; 细胞毒素相关基因A；CCD图像传感器；移动k-均值算法

引言

目前胃癌已成为威胁人类健康的重要杀手，而其早期诊断对于治疗则起着至关重要的作用。幽门螺旋杆菌(HP)感染已被证实是慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠胃溃疡等肠胃疾病的重要致病因素，且与胃癌的发展密切相关。细胞毒素相关基因A是其重要的毒力因子，它是经细胞毒素相关基因致病岛编码的IV型分泌系统注入到宿主细胞内发挥毒性作用的。一些研究表明细胞毒素相关基因A传输到上皮细胞会导致促炎性细胞因子的分泌，细胞结构的改变和细胞的增殖，而细胞增值和凋亡的失衡与肿瘤的发生发展有着密切的关联[1-2]。若能通过某种手段进行细胞毒素相关基因A的检测，将有助于胃癌的早期诊断和治疗。

免疫层析技术是20世纪90年代初发展的新兴快速检测技术，它的基本原理是抗体和抗原之间的相互作用。现今胶体金免疫层析试纸条，由于它便捷和简单的特性，已被广泛用于多个领域、多种项目的检测。已有文献报道利用胶体金免疫层析试纸条检测蓖麻毒素、可铁宁、灭蝇胺等[3-5]。在本实验中，将采用胶体金免疫层析试纸条进行细胞毒素相关基因A的检测。然而，现在大多数的胶体金免疫层析试纸条检测都存在如下问题。首先，检测人需具备一定的专业知识，当照明条件不好，或者存在其他干扰因素时易产生人为误差；其次，当检测样品浓度处于临界检测范围时，胶体金免疫层析试纸条检测带的显色浅且不规则，裸眼难以辨别，人为主观因素可能会影响检测结果；最后，现今的胶体金免疫层析试纸条检测只是定性检测，缺乏一定的数据记录。鉴于以上缺陷，本研究开发了一套进行细胞毒素相关基因A胶体金免疫层析试纸条定量检测的免疫层析设备。

1 免疫层析检测仪硬件系统

本研究的设备是基于CCD图像传感器搭建的免疫层析检测系统(外形见图1(a))，主要用于采集胶体金免疫层析试纸条图像，实现定量检测。试纸条一般由样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸收垫和底板组成，如图1(b)。在样品垫处试滴加样品后，样品溶液中的抗原会随着溶液移动，在结合垫处与其中的胶体金标记抗体1反应形成红色的抗原抗体复合物，然后继续层析移动向前。样品中的抗原在检测线处被抗体2截获，红色免疫复合物增多，形成一条红线。若样品中不存在待测物，则无法在检测线处形成红线，判断检测结果为阴性。

设备的主要模块见图1，主要包括样品模块、光源模块、采集模块、电源模块、散热模块以及PC模块。

光源模块选择了环形白色发光二级管(light emitting diode,LED)(大恒图像SQR-56-SW)作为激发光源(如图1 (c))，因为环形结构的设计可以让试纸条接受更加均匀的光照，避免阴影的产生，为采集到质量较好的试纸条图像提供基础。同时，LED还具有发光强和能耗小的特点。该LED的供电参数为12 V DC/4.1 W。

在光源的激发下，胶体金免疫层析试纸条发生显色反应，被采集模块采集，然后传送至PC模块等待软件系统的处理。对于采集模块来说，选择一个优良的光学传感器对于获取图像的效果起着至关重要的作用。现今常用的光学传感器包括光电二极管、光电倍增管、线性CCD和图像传感器。其中，光电二极管、光电倍增管和线性CCD的检测区域有限。在检测区域受限的情况下，则需要增加传动装置推动试纸条移动来实现全部区域的检测，但是这种方式增加了设计的复杂性，以及降低了检测的速率，而图像传感器则可以提供更加广泛的检测区域。基于图像传感器的这个优势，本研究选择其作为免疫层析检测设备的光学检测器件。CCD和CMOS(互补金属氧化物半导体)是两种现今使用最为广泛的图像传感器件，相较于CMOS，CCD具有更加灵活和优良的成像质量，特别是在低亮度的环境下具有明显的优势[6]，而该设备正是处于密闭的环境中，光源的亮度也非常有限，所以成像质量更好的CCD图像传感器成为了最佳选择。在本研究中，选择了大恒图像MER-125-30UM/UC系列的CCD工业数字相机作为图像传感器(如图1 (d) )，其性能参数见表1。该CCD图像传感器的体积仅有29 mm29 mm29 mm，极大地节省了空间，减小了体积；而USB接口的设计使得设备的使用更加广泛；彩色光谱可以提供更多的图像信息量。

图1 设备及部分组件实物图。(a)设备外部图；(b)试纸条；(c)环形白色发光二极管；(d)CCD图像传感器Fig.1 Photos of the device and some core components.(a) Photo of the device; (b) Test strip; (c) Circular white light LED; (d) CCD image sensor

PC模块搭载了2 GB内存，320 GB硬盘容量，采用N2800 CPU。由于该笔记本电脑体积较小，仅有10.1 in，便于与其他模块组装整合。

表1 CCD图像传感器的性能参数Tab.1 Performance parameter of CCD image sensor

2 免疫层析检测仪软件系统

2.1软件系统的功能

本实验开发了一套与免疫层析检测设备相配套的软件系统。该软件系统是基于微软基础类库(MFC)平台、C++语言环境开发的。它主要用于人机交互，将由免疫层析检测设备采集的胶体金免疫层析试纸条图像呈现出来，并且对其进行数据处理和分析，得出诊断结果。除此之外，该软件系统还具有以下功能：患者信息的录入、数据库的保存与查询、打印诊断报告等。该软件系统的流程图如图2。

图2 软件系统的流程图Fig.2 Flow diagram of software system

图3 胶体金免疫层析试纸条的灰度图Fig.3 Grey-scale figure of a colloidal gold immuntographic strip

2.2软件系统中的图像处理算法

由免疫层析检测设备采集到的胶体金免疫层析试纸条图像包括试纸条带(质控带、检测带)和背景两部分。实验所需要的只是质控带(C带)和检测带(T带)的信息(如图3)，所以消除图像背景，提取出两个条带是诊断过程中非常重要的一步。为了消除大部分背景的干扰，先提取包含两条试纸条带的部分。从图3中可以看出，仅保留试纸条带边缘A和B之间的部分能够极大地减小背景区域。本实验采用了对图像每纵列所有像素的灰度值求和的方法，得到图4。从图4中可以看到明显的两个峰，该峰值处即试纸条图像的边缘。将图4分别与图5中(a)和(b)比较，可以发现其中显示的边缘位置正好与图4中峰值位置相符。因而，该方法可以实现边缘A和边缘B之间条带部分的截取。

图4 试纸条图像各纵列像素灰度值求和曲线图Fig.4 Figure to Summation of pixels’ intensity in each line

图5 左右边缘位置坐标。(a)边缘A位置坐标；(b)边缘B位置坐标Fig.5 Coordinate of left and right margin.(a) Coordinate of margin A; (b) Coordinate of margin B

图像截取好后，还需将C带和T带分离，本研究采用了基于HSI色彩空间的移动k-均值的图像分割方法。HSI色彩空间比较接近人眼对彩色感知的颜色空间，它消除了3个分量之间的关联性，使得可以对各个分量进行独立的处理。H代表色调，S代表饱和度，I代表亮度。在这里，要利用H分量来进行试纸条图像的分割。

k-均值算法是一种被广泛使用的聚类分割算法[7]。k-均值算法是将全部的数据分配到不同的类中，每一个类拥有一个聚类中心，类中的成员具有与所属类的聚类中心相近的特质。但是k-均值算法对聚类中心的初始化很敏感，如果初始的聚类中心选择不当，可能会导致较差的分割效果。移动k-均值是k-均值的改进算法，它提出了适应度的理念来解决k-均值算法的缺陷，有效地解决了聚类中心初始不当的问题。本研究采用该算法实现了C带和T带的有效分割。

实验中，先将采集到的RGB图像进行简单的去噪声处理，然后转换为HSI图像。接着，利用H分量进行移动k-均值图像分割，移动k-均值算法主要思路如下[8-9]：

考虑一个包含有N个数据的图像，将被分到Nc个聚类中心中去。Vi代表第i个将被分配的元素，Cj表示第j个聚类中心(其中i=1,…,n;j=1,…,Nc)。所有的元素都会根据欧几里得距离被分配至最近的类中。通过多次重复计算，利用适应度来确认各类是否分配完毕。

3 结果

3.1参数的选择

表2 不同α0取值下的MSE的值Tab.2 MSE values with different α0

从表2中可以看出α0(移动-k均值算法中的一个初始参数)取0.29或0.30时MSE具有最小值，在该实验中选择0.3作为α0的标准值。处理后的图像如图6，左图是算法处理后的RGB图像，可以明显的看到两个条带被分割出来；右图是二值图像。

图6 算法处理后的试纸条图像。(a) RGB试纸条图像；(b) 二值试纸条图像Fig.6 Images after processing of algorithm.(a) RGB test strip image; (b) Binary test strip image

3.2图像分割结果的对比

为了验证该算法测量值的准确度，将该算法测得的C带和T带值分别与手动框取条带测得的C带和T带的值进行对比。针对3种不同浓度的试纸条带进行了比较测试，结果见表3，从中可以发现用图像分割算法测得的试纸条带值与手动框取条带的检测值非常接近，可见该图像分割方法是可取的，并且取得了可观的效果。

3.3诊断结果

检测结果分为3种：阳性、阴性和失效(见图7)。阳性即质控带和检测带都有显色，而阴性是质控带显色，检测带不显色。如果质控带不显色，则视该试纸条带失效。

表3 不同浓度细胞毒素相关基因A试纸条带C带和T带手动诊断和自动诊断值的对比Tab.3 Comparison between manual detection value and auto detection value of strip C and strip T

图7 3种检测状态的试纸条。(a)阳性；(b)阴性；(c)失效Fig.7 Three status of strips.(a)Positive; (b) Negative; (c) Invalid

本研究对不同浓度的细胞毒素相关基因A样品，用胶体金免疫层析试纸条进行了检测，以浓度的对数作为横坐标，T带与C带检测值之比作为纵坐标，绘制出曲线图(见图8)。经实验验证，当T/C的比值小于1.52时，可鉴定诊断结果为阳性。图9显示了一份阳性检测报告图，软件系统自动计算出T/C值，与CUTOFF值(阴阳性的界限)进行比较，得出诊断结果。

图8 不同浓度试纸条的T/C比值图Fig.8 T/C ratio of different concentration strips

图9 诊断报告Fig.9 Diagnosis report

此外，本研究还分别检测了50例阳性和50例阴性的细胞毒素相关基因A胶体金免疫层析试纸条。检测结果的灵敏度和特异性分别定义为

灵敏度=

(1)

特异性=

(2)

检测结果显示灵敏度和特异性均为100%。本实验所提供的样品均为实验室制备，与临床样品仍存在一定的差距，所以临床检测结果可能仍然会出现少部分假阳性与假阴性。

4 讨论和结论

一些早期研究开发设计了类似的试纸条检测设备[10,13]，此类设备采用CCD工业模拟相机作为采集模块，即采集到的模拟图像需转换为数字图像，必须利用图像采集卡来实现此转换。 由于图像采集卡仅适用于台式电脑的插槽，这极大地限制了该设备的应用。而本研究中采用CCD工业数字像机作为图像传感器，它通过USB接口实现与PC模块的数据传输，不仅使数据传输快而稳定，同时可以消除模数转换中产生的噪声。该CCD图像传感器的选择在降低成本的同时，还为便携应用创造了条件。

还有一些研究[12]采用PMT(光电倍增管)作为采集模块，PMT是点或者线测量，只能读取分立的谱线，因此采集部位很窄，或者需要机械传动装置来完成采集，这就增加了设备的复杂性，同时采集速度要慢于CCD图像传感器。

此外，相比于其他设备，本系统采用市电和锂电池组双模供电方式。在市电模式下，采用交流电对电源模块、散热模块以及采集模块供电。而在脱离市电的情况下，则由锂电池组直流供电，并且可持续工作 6 h以上，为偏远地区或者灾区的应用提供了便利。在软件设计方面，提供了一套完整的人机交互界面，同时首次将基于HSI色彩空间的移动k-均值算法用于胶体金试免疫层析试纸条图像的处理。

本研究开发了一套完整的胶体金免疫层析检测设备，包括硬件部分的设计和软件系统的编写。该设备通过CCD图像传感器采集试纸条图像传输至PC模块，利用软件系统实现人机交互。在之前的文章里[10-16]，免疫层析检测设备利用图像采集卡来实现试纸条图像的采集，这极大地限制了该设备的应用范围。本研究选择的CCD数字相机不再需要模数转换装置，简化了设备。同时，相比于利用PMT，CCD图像传感器具有更快的检测速度。本研究的软件系统不仅可以实现信息的输入，还能够利用算法进行诊断，同时建立了与数据库和打印机的连接，极大地方便了使用。在胶体金免疫层析试纸条图像处理中，主要采用了基于HSI色彩空间的移动k-均值图像分割算法，从与人工分割的对比来看，该分割效果是令人满意的。最后，使用该设备进行了100个细胞毒素相关基因A免疫层析试纸条带样本的检测，结果显示特异性和灵敏度都是100%，表明研制的胶体金免疫层析检测仪的准确度是可靠的。另外，还绘制了细胞毒素相关基因A胶体金免疫层析试纸条不同浓度的T/C比值曲线图，实现了定量检测。在未来的设计中，还可以考虑多种条带同时检测，或者采用无线传输模式，进一步的缩小设备的体积，不断改进硬件和软件部分，使其达到临床应用水平。

[1] Minohara Y,Boyd DK,Hawkins HK,etal.The effect of the cag pathogenicity island on binding of helicobacter pylori to gastric epithelial cells and the subsequent induction of apoptosis [J].Helicobacter,2007,12(6):583-590.

[2] 赵晶,杜雅菊,赵瑞波,等.幽门螺杆菌CagA蛋白与胃癌组织中 Bcl-2、p53蛋白表达的关系 [J].World Chin J Digestol,2003,11(5):554-557.

[3] Shyu RH,Shyu HF,Liu HW,etal.Colloidalgold-based immunochromatographic assay for detection of ricin [J].Toxicon,2002,40(3):255-258.

[4] Nian Hungchi,Wang Jun,Wu Hong,etal.Electrochemical immunoassay of cotinine in serum based on nanoparticle probe and immunochromatographic strip [J].Analytica Chimica Acta,2012,713(0):50-55.

[5] Le Tao,Yan Peifeng,Xu Jian,etal.A novel colloidal gold-based lateral flow immunoassay for rapid simultaneous detection of cyromazine and melamine in foods of animal origin [J].Food Chemistry,2013,138(2-3):1610-1615.

[6] 熊平.CCD 与 CMOS 图像传感器特点比较 [J].半导体光电,2004,25(1):1-4.

[7] Siddiqui FU,Mat Isa NA.Enhanced moving K-means (EMKM) algorithm for image segmentation [J].IEEE Trans Consumer Electronics,2011,57(2):833-841.

[8] Mat Isa NA,Sulaiman SA,Ngah UK.Adaptive fuzzy-K-means clustering algorithm for image segmentation [J].IEEE Trans Consumer Electronics,2010,56(4):2661-2668.

[9] Alias MF,Mat Isa NA,Sulaiman SA,etal.Modied moving k-means clustering algorithm[J].International Journal of Knowledge-based and Intelligent Engineering Systems,2012,16:79-86.

[10] Zhang Xueqing,Li Ding,Cui Daxiang,etal.A CCD-based reader combined quantum dots-labeled lateral flow strips for ultrasensitive quantitative detection of anti-HBs antibody [J].J Biomed Nanotechnol,2012,8(3):372-379.

[11] Zhang Xueqing.Image processing for the CCD based lateral flow strip detector [J].Nano Biomed Eng,2010,2(4):214-217.

[12] Huang Lihuan,Zhou Lei,Zhang Youbao,etal.A simple optical reader for upconverting phosphor particles captured on lateral flow strip[J].IEEE Sensors Journal,2009,9(10):1185-1191.

[13] Liu Yali,Wang Qiaohua,Wang Xiliang.Automatic identification of reagent strips for detecting sulphonamides based on machione vision[J].JDCTA,2013,7(1):318-326.

[14] Mei Jianchun,Ye Qing,Zhou Wenyuanetal.Development and study of lateral flow test strip reader based on embedded system[J].ICEMI,2011,1:201-204.

[15] Gui Chen,Wang Kan,Li Chao,etal.A CCD-based reader combined with CdS quantum dot-labeled lateral flow strips for ultrasensitive quantitative detection of CagA [J].Nanoscale Research Letters,2014，9:57.

[16] Zhang Xueqing,Li Ding,Wang Can,etal.A CCD-based reader combined quantum dots-labeled lateral flow strips for ultrasensitive quantitative detection of anti-HBs antibody [J].Journal of Biomedical Nanotechnology,2012，8:372-379.

CCD-BasedColloidalGoldImmunochromatographicDevice

Gui Chen Dai Xuan Wang Kan Cui Daxiang*

(ResearchInstituteofMicro/NanoScienceandTechnology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China)

immunochromatographic; cytotoxin associated gene A (CagA); CCD image sensor; movingk-means

10.3969/j.issn.0258-8021.2015.02.015

2013-10-30，录用日期:2014-11-02

国家自然科学基金(81101169,81225010)；国家高技术研究发展计划(863计划)(2012AA022703)

R318

D

0258-8021(2015) 02-0237-06

*通信作者(Corresponding author)，E-mail:dxcui@sjtu.edu.cn