丹参酮ⅡA对家兔急性心肌梗死后心肌钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ信号通路及室性心律失常的影响

周代星 王照华

基础研究

丹参酮ⅡA对家兔急性心肌梗死后心肌钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ信号通路及室性心律失常的影响

周代星 王照华

目的 观察丹参酮ⅡA对急性心肌梗死后钙调蛋白（CaM）、钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）mRNA表达和室性心律失常的影响及发生机制。方法 36只家兔随机分为假手术组、心肌梗死组和丹参酮ⅡA组，每组12只。结扎冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死模型。氯化三苯基四氮唑染色测量心肌梗死面积，心电监护仪持续监测室性心律失常的发生并记录，实时逆转录聚合酶链反应检测左室CaM、CaMKⅡ mRNA的表达。结果 丹参酮ⅡA组心肌梗死面积[（38.15±4.03）%]、室性心律失常的发生率[（45.8±0.04）%]较心肌梗死组[（47.49±5.27）%、（95.8±0.02）%]明显减少（P＜0.05），CaM、CaMKⅡ mRNA 表达较心肌梗死组明显下降（P＜0.05，P＜0.01）。结论 丹参酮ⅡA通过下调急性心肌梗死后心肌细胞CaM、CaMKⅡ mRNA表达，降低室性心律失常的发生，机制可能与其阻断Ca2+/CaM-CaMKⅡ 信号转导途径有关。

丹参酮ⅡA； 急性心肌梗死； 室性心律失常； 钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ

急性心肌梗死后心肌发生电生理重构引起恶性室性心律失常是导致患者猝死的重要原因。近年来研究发现，Ca2+/钙调蛋白（CaM）依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是一种致心律失常的信号分子，可作为抑制心梗后恶性心律失常的新靶点[1]。丹参酮ⅡA是传统中药丹参的有效活性成分，临床上广泛用于冠心病治疗。临床观察发现，丹参酮ⅡA能降低缺血性心脏病室性心律失常及心脏事件发生率[2]。既往研究发现，丹参酮ⅡA具有干预肥厚心肌电生理异常的作用[3]，但其作用机制尚未明了。本研究通过家兔急性心肌梗死模型，观察丹参酮ⅡA对急性心肌梗死后CaM、CaMKⅡmRNA表达和室性心律失常发生率的影响，探讨丹参酮ⅡA能否通过抑制CaMKⅡ信号转导通路影响室性心律失常的发生。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 实验对象为健康新西兰大白兔，体重2.0～2.5 kg，雌雄兼用，各18只，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。实验兔36只按随机数字表法分为假手术组、心肌梗死组和丹参酮ⅡA组，每组12只。

1.2 试剂和仪器 主要试剂：丹参酮ⅡA磺酸钠注射液购自上海第一生化药业有限公司，规格10 mg/2 ml，批号H31022558；氯化三苯基四氮唑（TTC）购自Sigma公司，RNAisoPlus提取液（日本TaKaRa公司）；RT-PCR试剂盒（Toyobo公司），PCR扩增引物（上海申工）。

主要仪器：RM6420B/C生物信号采集系统（成都仪器厂）、TKR-200C小型动物呼吸机（江西特力麻醉呼吸设备公司）、SP-Ⅲ心电监护仪（美国COLIN公司）、实时荧光定量PCR仪（ILLumina公司）、PCR仪（东胜创新生物科技有限公司）。

1.3 兔急性心肌梗死模型制作及标本保存 新西兰大白兔36只，其中24只以3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）和 30%乌拉坦（300 mg/kg）耳缘静脉注射，麻醉良好后，在动物呼吸机的支持下，经开胸结扎冠状动脉左前降支，建立急性心肌梗死模型。结扎线以下近心尖的左室前壁出现心肌青紫，心肌收缩力降低，心电图呈ST段弓背向上抬高0.5 mV且30 min内不回落，为模型制作成功。将成模家兔随机分为心肌梗死组和丹参酮ⅡA组，分别于心梗后1 h、8 h从耳缘静脉给予生理盐水5 ml、丹参酮ⅡA磺酸钠注射液3 ml/kg[溶于生理盐水（1 ml/kg）中]；记录家兔心电图，12 h后处死，迅速取出心脏，经磷酸盐缓冲液冲洗后，去除心房和右心室，将左室及室间隔于-80℃保存。假手术组家兔开胸但不结扎冠状动脉左前降支，余同心肌梗死组。

1.4 TTC染色法测量心肌梗死面积 将左室于-80℃冰冻5 min，然后沿左室长轴将心室水平切为厚2～3 mm的心肌片，再置于1%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（pH8.5）中，37 ℃孵育 30 min，正常组织被染成红棕色，梗死区未着色，以梗死心肌占左室心肌重量的百分比作为梗死面积。

1.5 心肌组织CaM、CaMKⅡmRNA表达水平检测 取左室游离心肌组织约5 μg立即放入预冷（4℃）匀浆液中，使用特别电极制成组织匀浆，然后低温离心（4 ℃，12 000 r/min，20 min），取上清液置于Ep管中待测。按照RNAiso Plus提取液操作说明提取上述收集上清液总RNA。按照逆转录试剂盒的要求将RNA逆转录为cDNA，以其为模板加入引物进行PCR扩增。CAM引物序列：上游为5′-GCTGCCTCTTCAAAATCGCC-3′， 下 游 为 5′-CTCTGCACTGTGTACCTCGG-3′。CaMKⅡ引物序列：上游为 5′-TCTCACCACCATGCTGGCTAC-3′，下游为 5′-TTCCTGTTTCCGCACTTTGG-3′。PCR反应体系（20 μl）包括：cDNA 工作液 4 μl，上游引物及下游引物 （100 μl） 各 0.4 μl，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix（2×）10 μl及高压灭菌去离子水5.2 μl反应条件如下：50℃ 2 min，95℃10 min后进入循环（95℃ 30 s，60℃ 30 s，循环40次）。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳（0.5×TBE电泳液），拍照后经美国Bio-Rad蛋白凝胶分析软件Quantity One对电泳条带进行吸光度扫描分析，以内参β-actin吸光度值进行校正。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计数资料用例数表示，计量资料以±s表示，计数资料采用卡方检验，计量资料组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组心肌梗死面积和室性心律失常发生情况比较 假手术组未出现心律失常，心肌梗死组、丹参酮组均出现各种室性心律失常（均P<0.01），丹参酮组心肌梗死面积及室性心律失常的发生均较心肌梗死组明显减少（P<0.05）。见表1。

2.2 三组心肌CaM、CaMKⅡ表达水平比较 心肌梗死组、丹参酮组心肌CaM、CaMK mRNA表达均明显高于假手术组（P<0.05，P<0.01），而丹参酮组心肌CaM、CaMK mRNA表达明显低于心肌梗死组（P<0.05，P<0.01）。见表 2。

表1 三组心肌梗死面积和室性心律失常发生情况比较（±s）

表1 三组心肌梗死面积和室性心律失常发生情况比较（±s）

注：OVPBS：偶发性室性早搏；FVPBS：频发室性早搏；VT：室性心动过速；VF：心室颤动。与假手术组比较，aP<0.01；与心肌梗死组比较，bP<0.05

组别 例数 OVPBS FVPBS VT VF 梗死面积（%）假手术组 12 0 0 0 0 0心肌梗死组 12 12a 12a 12a 10a 47.49±5.27a丹参酮组 12 6ab 6ab 5ab 5ab 38.15±4.03b

表2 三组心肌CaM、CaMKⅡmRNA表达水平比较（±s）

表2 三组心肌CaM、CaMKⅡmRNA表达水平比较（±s）

注：CaM mRNA：钙调蛋白mRNA；CaMKⅡ mRNA：钙调蛋白依懒性蛋白激酶ⅡmRNA。与假手术组比较，aP<0.01，bP<0.05；与心肌梗死组比较，cP<0.05

组别 例数 CaM mRNA CaMKⅡmRNA假手术组 12 1.00±0.00 1.00±0.00心肌梗死组 12 1.89±0.05a 2.34±0.19a丹参酮组 12 1.44±0.02bc 1.61±0.08ac

3 讨论

研究表明，Ca2+/CaM-CaMKⅡ信号转导途径在心肌重构及产生室性心律失常的过程中起着重要作用[4,5]。Ca2+作为胞浆内第二信使，与CaM形成Ca2+-CaM复合物后，进一步激活CaMKⅡ。CaMKⅡ被认为是一个分子开关，在静息状态时，存在自身抑制区封闭催化部位而处于非活化状态。急性心肌梗死后心肌细胞能量代谢发生障碍，心肌细胞内钙超载，Ca2+-CaM复合物与CaMKⅡ的自身抑制区结合，改变CaMKⅡ酶的构象，同时CaMKⅡ发生自身磷酸化，从而使CaMKⅡ激活[6]。CaMKⅡ激活后的作用底物非常广，包括多种与钙调节相关的蛋白，如L型钙通道[7]、肌浆网上ryanodine受体[8,9]，进一步影响细胞内钙稳态。一方面Ca2+通过L型钙通道内流，另一方面肌浆网钙离子大量释放，从而加重Ca2+超载。严重钙超载可诱发心肌细胞后除极，导致室性心律失常的发生[10]。

在高血压小鼠模型、冠状动脉结扎小鼠模型及主动脉狭窄小鼠模型中，都有心肌肥大和CaMKⅡ表达和（或）活性的上调[5,11]。转基因抑制CaMKⅡ可显著改变交感神经兴奋和心肌梗死后心脏的不利重构，抑制心肌细胞肥大和凋亡，降低肌浆网Ca2+负荷[12,13]，增加复极钾电流而缩短动作电位时程[14]，延长有效不应期，拮抗心律失常的发生[15]。这些研究结果表明，CaMKⅡ信号通路在心脏的结构重构和电重构中都起着重要作用[16]。本研究发现，急性心肌梗死后心肌细胞CaM、CaMKⅡmRNA的表达明显上调，各种室性心律失常发生率明显增加，进一步证实Ca2+/CaM-CaMKⅡ信号转导通路与急性心肌梗死后室性心律失常的发生密切相关。

丹参酮ⅡA磺酸钠为传统中药丹参的有效成分，已经被广泛用于临床治疗缺血性心脏病。既往研究发现，丹参酮ⅡA能够部分阻断TGFβ胞内信号转导，减少其诱导的下游细胞外基质的表达，抑制心肌纤维化[17]。丹参酮ⅡA对肥厚心肌细胞中存在的电生理异常有明确干预作用，它能减少Ca2+内流和恢复Ito钾电流活性，起到预防心律失常的作用[3]。近来一些研究认为，丹参酮ⅡA可以通过抑制miR-1的表达和细胞内钙来发挥对缺血心肌的保护作用，同时它也能够通过对miR-1和细胞通道表达的影响来发挥抗心律失常的作用[18,19]。本研究发现，丹参酮能缩小心肌梗死面积，下调心肌细胞CaM及CaMKⅡmRNA的表达，降低室性心律失常的发生。因此，我们推测丹参酮ⅡA可通过减轻心肌细胞钙超载、抑制心肌细胞内CaM的活化，进而抑制心肌CaMKⅡ活性，避免由钙稳态失衡诱发的室性心律失常，从而起到心肌保护作用。

总之，丹参酮ⅡA对缺血心肌具有良好的抗心律失常作用，可能与其阻断钙Ca2+/CaM-CaMKⅡ信号转导途径有关。

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Effect of TanshinoneⅡA on myocardial calmodulin-dependent protein kinaseⅡsignal pathway and ventricular arrhythmia induced by acute myocardial infarction in rabbit

Effect of TanshinoneⅡA on myocardial calmodulin-dependent protein kinaseⅡ signal pathway and
ventricular arrhythmia induced by acute myocardial infarction in rabbit

ZHOU Dai-xing，WANG Zhao-hua.Department of Emergency Medicine，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

：WANG Zhao-hua，E-mail：wangzhaohua726@163.com

ObjectiveTo explore the effect of tanshinone ⅡA（TSNⅡA）on mRNA expression of calmodulin（CaM）and calmodulin-dependent protein kinaseⅡ（CaMKⅡ）and ventricular arrhythmia induced by acute myocardial infarction （AMI）in rabbits and its possible mechanisms.MethodsThirty six rabbits were randomly divided into sham group，AMI group and TSNⅡA group.AMI model in rabbits was established by ligation of the left anterior descending coronary antery.The size of AMI was measured by TTC dyeing,ventricular arrhythmias were recorded，and mRNA expression of CaM and CaMKⅡwere observed by real time RT-PCR after AMI for twelve hours.ResultsThe AMI size（38.15±4.03）%and incidence of ventricular（45.8±0.04）%in TSNⅡA group were significantly lower than AMI group（47.49±5.27）%，（95.8±0.02）%（P＜0.05），and mRNA expression of CaM and CaMKⅡ in TSNⅡA group were downregulated significantly（P＜0.05，P＜0.01）.ConclusionTSNⅡA could reduce incidence of ventricular arrhythmias by inhibition of calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡsignal pathway.

TanshinoneⅡA； Acute myocardial infarcfion； Ventricular arrhythmia； Calmodulin-dependent protein kinaseⅡ

国家自然青年基金资助项目（项目编号：81001571）；湖北省自然科学基金资助项目（项目编号：2103CFB080）

作者单位：430030 湖北省武汉市，华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊内科

王照华，E-mail：wangzhaohua726＠163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．04．020

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2015）04-0368－04

2015-01-20）