辛伐他汀后适应对血脂正常大鼠缺血再灌注心肌保护作用

陈树杰

基础研究

辛伐他汀后适应对血脂正常大鼠缺血再灌注心肌保护作用

陈树杰

作者单位：056000 河北省邯郸市，邯郸市中心医院心内科

目的 探讨辛伐他汀药物后适应对缺血再灌注损伤大鼠髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）的影响及减少心肌损害的可能机制。方法 将30只SD大鼠随机分为假手术组（SH）、缺血/再灌注组（I/R组）和辛伐他汀后适应组（SIM组)，每组10只。通过结扎大鼠冠状动脉前降支制作心肌梗死模型。再灌注前，SH组、I/R组经颈静脉注射生理盐水1 ml；SIM组经颈静脉注射辛伐他汀（1 mg/100 g）。再灌注2 h后抽静脉血测定CK-MB、MPO、MDA，测量心肌梗死面积。结果 ①各组大鼠血脂均在正常值范围内；②与SH组比较，I/R组、SIM组CK-MB、MPO、MDA均增高（P＜0.05）；与 I/R组比较，SIM 组 CK-MB[（798.46±105.25）ng/ml比（1572.18±126.32）ng/ml]、MPO[（12.16±2.69）U/L 比（15.32±3.35）U/L]、MDA[（2.15±0.22）nmol/mg prot比（2.78±0.24）nmol/mg prot]下降（P＜0.05）；③与 SH 组比较，I/R 组、SIM 组心肌梗死明显（P＜0.05）；SIM 组心肌梗死面积小于 I//R 组[（35.79±4.77）%比（46.61±5.18）%，P＜0.05]。结论 辛伐他汀后适应治疗可以减轻大鼠心肌炎症反应，缩小心肌梗死面积，保护心肌并减轻缺血再灌注损伤。

辛伐他汀； 后适应； 缺血再灌注； 大鼠； 髓过氧化物酶； 丙二醛

心肌缺血后适应是指在心肌缺血后、长时间再灌注之前的一段时间内，对缺血心肌进行一次或多次短暂的心肌血流再灌注，以提高缺血心肌对之前缺血的耐受性。已有资料证实缺血后适应可挽救濒死心肌，减少梗死面积[1,2]。缺血再灌注的心肌损伤部分与中性粒细胞、血管内皮细胞和心肌细胞的相互作用有关，同时细胞因子起着调节和修饰作用。“药物后适应”指通过药物的作用激发机体内源性物质的释放以起到心肌保护作用。他汀类药物对血脂正常大鼠缺血后适应心肌保护作用的研究报道较少。本研究观察辛伐他汀后适应对血脂正常大鼠心肌损伤的保护效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验仪器、试剂、药品 7180型全自动生化分析仪（生产商：日本日立集团）；STUDENT LAB BASIC多导电生理仪（美国BIOPAC公司）；ECG-6511型心电图机（生产商：日本光电公司）；752型分光光度计（生产商：上海光谱仪器有限公司）；LDR4-84C低温离心机（生产商：北京医用离心机厂）；DH750型动物人工呼吸机（生产商：浙江大学医学仪器厂）。总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）试剂，均购于南京建成生物工程研究所。辛伐他汀购于中国食品药品检定研究院，使用无水乙醇溶解后加入与辛伐他汀等物质量的NaOH，50℃水浴2 h，调节pH至7.20，过滤除菌，整至4 mg/ml供注射用。

1.2 实验动物 健康清洁Ⅱ级SD大鼠30只，雄性，体重200～250 g。大鼠颗粒全价饲料饮食，河北医科大学实验动物中心提供（实验动物合格证号：911102）。

1.3 模型分组、给药 采用随机数字表法将实验用30只SD大鼠随机分为3组：假手术组（SH）、缺血/再灌注组（I/R组）和辛伐他汀后适应组（SIM组），每组10只。大鼠给药：SH组、I/R组再灌注前经颈静脉注射生理盐水1 ml；SIM组再灌注前给予辛伐他汀（1 mg/100 g）加生理盐水至1 ml后经颈静脉注射。

1.4 模型制备、评价 模型制备：1%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔内注射；连接心电图；行气管切开连接小动物呼吸机，设定参数为频率70次/min、潮气量 2 ml/100 g、呼吸比 2∶1、呼气末压力 10 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），依据大鼠呼吸情况调整参数。取左侧3～4肋间入路，于左心耳与肺动脉圆锥间穿6/0号丝线，硅胶管套扎前降支阻断血流，阻断前降支血流30 min后开通血管再灌注2 h制作I/R模型。SIM组大鼠阻断血流30 min后经颈静脉给予辛伐他汀进行药物后适应，开通血管再灌注2 h制模。假手术组在相同位置穿线打一松结。整个动物实验过程中操作及处理符合动物伦理学标准。

模型评价：结扎前降支30 min后，肉眼观察见结扎点远端心肌颜色呈发绀或蓝紫色，心肌收缩力明显减弱；心电图Ⅱ导联ST段抬高0.2 mV以上，QRS波群明显增宽，证实血管闭塞有效。再灌注后上述表现减轻，表示存在心肌再灌注。其中SH组、I/R组、SIM组各死亡2只、3只、2只大鼠，各组以剩余大鼠为实验对象。

1.5 实验指标检测 实验结束时所有入组大鼠开腹从下腔静脉取血约4 ml，加入促凝管，室温静置1 h，3000 r/min离心5 min，进行编码后放－20℃冰箱中保存。CK-MB、TC、TG测定：应用7180型全自动生化分析仪（日本日立公司）测定。MPO、MDA含量测定：详细操作参照试剂盒说明书进行。

1.6 梗死面积测定[3]抽血后开胸切取心脏，冰冻10 min后沿心脏底部横向切成1～2 mm厚的切片，置入37℃、浓度为1%的氯化三苯基四氮唑（TTC）磷酸盐缓冲液中20 min，再置入10%甲醛溶液中固定，24 h后计算心肌梗死面积。梗死心肌不着色呈白色，同一标本、同一测量者每次测量3遍，取平均值。计算公式：梗死面积=梗死区心肌面积（IS）/心肌片总面积（LVS）×100%。

1.7 统计学方法 使用SPSS 13.0统计学软件处理。计量资料以±s表示，组间比较应用单因素方差分析和最小显著差异LSD法。假设检验采用双侧检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血脂情况 SH组、I/R组、SIM组大鼠术后测定 TC 分别为（1.54±0.32）mmol/L、（1.60±0.33）mmol/L、（1.58±0.37）mmol/L，与大鼠 TC 正常值比较未见统计学差异（P＞0.05）。SH组、I/R组、SIM组大鼠术后测定TG分别为（0.71±0.28）mmol/L、（0.74±0.32）mmol/L、（0.70±0.31）mmol/L，与大鼠TG正常值比较未见统计学差异（P＞0.05）。

2.2 各组大鼠CK-MB、MPO、MDA比较 各组大鼠的CK-MB、MPO、MDA 有显著差异（P＜0.05）。与SH 组比较，I/R 组、SIM 组 CK-MB、MPO、MDA 均增高（P＜0.05）；与 I/R组比较，SIM 组 CK-MB、MPO、MDA 下降（P＜0.05）。见表 1。

表1 各组大鼠相关指标比较（±s）

表1 各组大鼠相关指标比较（±s）

注：SH组：假手术组；I/R组：缺血/再灌注组；SIM组：辛伐他汀后适应组；CK-MB：肌酸激酶同工酶；MPO：髓过氧化物酶；MDA：丙二醛；IS/LVS（%）：梗死区心肌面积（IS）/心肌片总面积（LVS）×100%。与SH组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05

IS/LVS（%）SH 组 8 417.62±91.44 8.44±2.17 1.61±0.08 0 I/R 组 7 1572.18±126.32a 15.32±3.35a 2.78±0.24a 46.61±5.18 SIM 组 8 798.46±105.25ab12.16±2.69ab 2.15±0.22ab 35.79±4.77b组别 例数 CK-MB（ng/ml）MPO（U/L）MDA（nmol/mg prot）

2.3 各组大鼠心肌梗死面积比较 SH组无心肌梗死；SIM组心肌梗死面积小于I/R组（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

2002年，华裔学者赵志清和美国学者Vinten Johansen将预处理的实验方法用于急性缺血发生后，首次提出缺血后适应（Postconditioning）的概念。与缺血预适应相比，缺血后适应具有更好的可预测性和临床可控性[4]。缺血后适应对缺血再灌注损伤心肌具有保护作用[5]，“药物后适应”越来越多的为研究者重视。目前缺血后适应对心脏的保护机制尚未完全阐明：减少氧自由基的产生、抑制线粒体钙超载、开放线粒体膜ATP敏感性钾通道、减弱各种炎症反应、改善血管内皮功能等机制均被不同学者提出。

心肌缺血再灌注损伤的主要机制是活性氧簇（ROS）及其引发的脂质过氧化反应。ROS增加使膜受体、膜蛋白酶和离子通道的脂质微环境改变，增加胞质溶胶钙，游离钙离子浓度减少，引发心律失常和心肌顿抑。MDA是膜脂过氧化反应的最终产物，是目前公认的能较好地反映ROS产生的间接指标。MPO是一种重要的溶体酶，存在于中性粒细胞胞浆的嗜天青颗粒中，既能间接定量反映心肌浸润中性粒细胞的数量，又能反映中性粒细胞激活程度。因此心肌组织中MDA、MPO含量的变化可反映心肌组织损伤的严重程度。

他汀类药物不仅能降低血清低密度脂蛋白，还具有抗炎、稳定斑块的作用[6-8]。他汀类药物通过抑制白细胞和内皮细胞间的相互作用，减少白细胞的渗出，减轻氧化应激反应，抑制炎症介质的释放[9]，降低引起组织损伤物质的化学活性。虽然已有大量研究[10,11]报道证实他汀类药物在缺血预适应中的作用，但关于他汀类药物在血脂正常大鼠心肌缺血后适应中对心肌保护作用的研究少见报道。

本研究显示，对于血脂正常大鼠，缺血再灌注组、辛伐他汀后适应组大鼠CK-MB、MPO、MDA、心肌梗死面积均高于模型组，证实制模成功。给予辛伐他汀进行药物后适应治疗显示，大鼠CK-MB、MPO、MDA、心肌梗死面积较缺血再灌注组下降，差异有统计学意义（P＜0.05），说明辛伐他汀可以起到保护心肌作用以减小心肌梗死面积，可能机制是通过减少活性氧簇、抑制炎症反应、减少氧自由基、保护膜稳定性等作用，起到心肌及心血管保护作用。本研究应用辛伐他汀使用无水乙醇溶解后加入等物质量的NaOH溶解，于前降支血流阻断30 min后经颈静脉给药后再灌注2 h，以发挥辛伐他汀的心肌保护作用[12]。

综上所述，经过辛伐他汀后适应治疗的血脂正常大鼠心肌损伤明显减轻，证实辛伐他汀能够通过抑制氧自由基活性及炎症应激反应等途径起到心肌保护作用。但辛伐他汀在药物后适应治疗过程中具体机制仍需进一步研究探讨。

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Effects of postconditioning with Simvastatin in ischemia-reperfusion injury rats with normal cholesterol

Effects of postconditioning with Simvastatin in ischemia-reperfusion injury rats with normal cholesterol

CHEN Shu-jie.Department of Cardiology，Handan Center Hospital，Handan 056000，China

ObjectiveTo test the effects of postconditioning with Simvastatin on MPO and MDA in ischemia-reperfusion injury rats with normal cholesterol.Methods30 SD rats were randomly divided into there groups：Sham operation group（SH），Ischemia-reperfusion injury model group（I/R），Simvastatin postconditioning group（SIM）.The ischemia-reperfusion injury models of rats were established by left anterior decending branch of coronary artery ligature.SH，I/R group：1 ml normal saline was injected through the internal jugular vein before reperfusion.SIM group：Simvastatin 1 mg/100 g dissolve to 1 ml normal saline was injected through the internal jugular vein before reperfusion.After two hour reperfusion，rats were executed，plasma CK-MB，MPO，MDA and myocardial infarct size were detected.Results⑴The plasma cholesterol concentration of there groups rats was measured in normal range.⑵The study shows the CK-MB，MPO and MDA of I/R，SIM group were significantly increased compare with SH group（P＜0.05）.The CK-MB，MPO and MDA of SIM group was significantly decreased compare with I/R group，CK-MB[（798.46±105.25）ng/ml vs（1572.18±126.32）ng/ml]，MPO[（12.16±2.69）U/L vs（15.32±3.35）U/L]and MDA[（2.15±0.22）nmol/mg prot vs（2.78±0.24）nmol/mg prot]（P＜0.05）.⑶The myocardial infarct size of I/R，SIM groups were significantly increased compare with SH group[（35.79±4.77）%vs（46.61±5.18）%，P＜0.05].These of SIM group was significantly decreased compare with I/R group.ConclusionSimvastatin postconditioning can relieve inflammatory response，reduce myocardial infarction area，protect myocardial cells，and attenute myocardial ischemia-reperfusion injury.

Simvastatin； Postconditioning； I/R； Rats； MPO； MDA

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．04．021

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2015）04-0372－04

2015-01-04）