土壤中石油烃与降解菌群的相互作用研究

左丽敏，马晓阳，李智民，余荣华，王 燕,冯 亮，刘 慧，彭正华

(1.中国地质大学(武汉)生物地质与环境地质国家重点实验室，湖北 武汉 430074；2.中国地质大学 (武汉)环境学院，湖北 武汉 430074；3.湖北省地质局水文地质工程地质大队，湖北 荆州 434020)

土壤中石油烃与降解菌群的相互作用研究

左丽敏1，2，马晓阳1，2，李智民3，余荣华3，王 燕1，2,冯 亮2，刘 慧1，2，彭正华3

(1.中国地质大学(武汉)生物地质与环境地质国家重点实验室，湖北 武汉 430074；2.中国地质大学 (武汉)环境学院，湖北 武汉 430074；3.湖北省地质局水文地质工程地质大队，湖北 荆州 434020)

以江汉油田石油污染土壤为研究对象，通过室内模拟修复试验，向石油污染的土壤中添加降解菌群的营养液后，在不同处理时间检测土壤中的石油烃含量、组成以及微生物的活性、多样性和功能基因的变化，研究土壤中石油烃与微生物的相互作用规律。试验结果表明：在添加LB培养基菌悬液的土壤中石油烃在35 d内降低了30%，其中低分子量正构烷烃和多环芳烃先降解，高分子量正构烷烃和多环芳烃后降解，同时生成低分子物质;采用ARISA技术对DNA-ITS-PCR产物分析发现，降解菌群添加至土壤后很快成为优势菌，但随着时间的延长土壤微生物多样性发生较大的变化，微生物功能基因多样性检测显示，降解菌群处理土壤前期微生物可能主要以烷烃降解过程中生成的醇类等物质为底物，而后期可能以芳香类降解过程中生成的酚羟类物质为底物。

石油污染土壤；生物降解；微生物活性；微生物多样性；功能基因多样性

石油开采、冶炼、使用和运输过程中遗漏事故等造成严重的环境污染问题，它不仅降低了土壤的性能，而且其中有毒物质还会污染地下水，进而对人类健康构成威胁[1-2]。不仅如此，石油污染对微生物生态环境也具有较大的影响，有报道称[3]，石油污染土壤对微生物的群落结构及种群分布具有胁迫性，在污染程度不同的土壤中微生物的分布特征具有很大的差异。因此，石油污染土壤治理成为当前亟待解决的问题。

石油污染土壤的治理早先多采用物理、化学等方法，而发展较晚的生物技术由于克服了物理、化学等方法的诸多缺点，以其经济、有效、安全、简便、无二次污染的特点受到人们的青睐，已成为当今石油污染土壤治理的主要途径[4-7]。作为生物修复的主要角色，微生物的动态监测极为重要，因此针对微生物多样性的研究也越来越受到学者们的关注。目前关于这方面的报道也相当广泛[8]，如末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析技术[9]、单链构象多态性(SSCP)技术[10]、变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术[11-12]等。近年来，Fisher和Triplett所创的ARISA技术[13]在国内外也逐渐发展起来。ARISA全称自动核糖体间隔基因分析(Automated ribosomal intergenic spacer analysis)，它通过可以分辨的荧光峰的总数代表被分析样品中物种的总体数目，基因片段的大小也可以与基因库中的数据进行比较，以得到更多生物信息。针对这一技术，多位学者对该技术所用引物也进行了研究，其成果显著[14-16]。

据报道[17]，位于潜江境内的江汉油田是著名的鱼米之乡，至20世纪七八十年代油田开发以来，由于开采过程中原油的滴漏以及油井废弃造成的原油渗漏，使其在土壤中迁移，导致开采区及附近农田遭受严重的石油污染，土壤中石油烃含量所占比例最高已达到24.67%[18]。为此，本文以江汉油田石油污染土壤为研究对象，拟通过室内模拟修复试验，研究石油污染土壤生物修复过程中石油烃的降解特点及其对土壤微生物多样性的影响，旨在为江汉油田土壤原位生物修复提供科学依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原油：江汉油田采油厂。

LB培养基(g/L)：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，超纯水1 L，pH值7.2。

无机培养基(g/L)：K2HPO4·3H2O 1 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，CaCl20.02 g，NH4NO31 g ，pH值7.2，FeSO4痕量，MnSO4·H2O痕量，超纯水1 L。

固体培养基：液体培养基中加入15～20g/L琼脂。以上液体培养基均需在121℃高压灭菌20 min。

有机物检测所需试剂：四氯化碳(环保级)；正己烷(色谱纯)；二氯甲烷(色谱纯)；正构烷烃(C15～C34)标准溶液100 mg/L(使用时将其逐级稀释成所需浓度)；16种多环芳烃标准溶液200 mg/L(使用时将其逐级稀释成所需浓度)。

PCR及凝胶电泳所需试剂：Master Mix；琼脂糖；核苷酸胶体染料；Maker；Loading Buffer；50TAE(使用前稀释50倍)；PCR特异性引物[19-20]见表1。

表1 PCR特异性引物信息

1.2 试验方法

1.2.1 石油降解菌的培养和鉴定

从示范工程场地采集长期被石油污染的土壤，将其置于以场地原油为唯一碳源的富集培养基中进行驯化和筛选[4]，最终获得能以石油为唯一碳源的微生物菌群。采用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌悬液中DNA，并将其置于-20℃下保存，尽量避免反复冻融。

以上述提取的DNA为模板，选择27F和1492R通用引物进行16S-PCR扩增，25 μL的PCR反应体系如下：12.5 μL Master Mix，0.5 μL引物F，0.5 μL引物R，1 μL DNA模板，10.5 μL ddH2O。PCR扩增程序为：94℃预变性4 min，94℃变性45 s，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。将扩增产物送至上海生工公司检测，并将所得序列信息输入NCBI数据库进行BLAST分析。

1.2.2 试验设计

称取示范工程场地中石油污染土壤(石油烃含量1.7%)250 g，向其中分别添加50 mL水菌悬液和LB培养基菌悬液，并以添加无菌水为对照，每组两个平行，于30℃恒温培养箱中培养，适时喷洒无菌水，使其保持约30%的含水率，定期检测污染土壤中石油烃含量与组成、微生物多样性与活性、微生物功能基因多样性等。

1.2.3 检测方法

土壤总石油烃含量用四氯化碳作萃取剂进行萃取，并用红外测油仪进行检测。土壤有机物含量及组成经二氯甲烷[21]萃取后，利用微波萃取-硅胶氧化铝层析柱净化，同时添加二氯甲烷和正己烷的混合溶液(1∶1)洗脱，洗脱液浓缩后用气相色谱仪分析多环芳烃和正构烷烃的含量。

微生物活性通过酶标仪监测48 h内OD值得出其生长曲线。使用Power Soil DNA Isolation Kit试剂盒(深圳安必胜公司)对定期所取土样的DNA进行提取后，用HEX荧光标记引物ITSF(GTCGTAACAAGGTAGCCGTA)和ITSReub(GCCAAGGCATCCACC)[14]进行PCR扩增，将扩增产物送到上海生工公司采用ARISA技术检测，检测结果利用Peakscanner软件分析。微生物功能基因多样性则是将引物换成表1中所示的引物进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测，并根据条带的有无确定降解基因的存在。

2 结果与分析

2.1 石油烃的降解效果

本试验采用无菌水菌悬液和LB菌悬液两种方式制作修复菌剂，前者不含碳源和无机营养物质，后者含有碳源和氮、磷、钾等无机营养元素。

图1为两种菌剂方式对土壤中石油烃的降解效果。由图1可知，不加菌水和添加水菌悬液的土壤中石油烃含量变化较小，两者的趋势相近；添加LB菌悬液的土壤中石油烃含量在前35 d下降较快，其降解率为30.2%，35 d后由于LB培养基中的营养消耗殆尽，从而石油烃停止降解。由此说明，微生物对有机物的作用存在共代谢。因此，使用降解菌群进行石油烃污染修复时，必须要考虑供给微生物生长繁殖所需的碳、氮、磷、钾等营养元素。

2.2 石油烃降解过程中脂肪烃组成的变化

经LB菌悬液处理后石油烃降解过程中正构烷烃的组成发生了变化(见图2)，LB菌悬液处理土壤15 d后，较短碳链(C15～C25)的脂肪烃含量降低，说明较短碳链的脂肪烃较容易被降解；处理30 d后长链脂肪烃含量降低，短链脂肪烃含量增加，表明长链脂肪烃开始降解生成短链脂肪烃。

2.3 石油烃降解过程中多环芳烃组成的变化

经LB菌悬液处理后石油烃降解过程中多环芳烃(PAHs)的组成也发生了明显的变化(见图3)，与正构烷烃相似，LB菌悬液处理土壤15 d后，3环的菲和4环的荧蒽已降解；处理30 d后，6环的茚苯(1,2,3-cd)芘比例降低，5环的苯并(k)荧蒽和苯并(b)荧蒽比例增加。总的来说，少环的多环芳烃先发生降解，多环的多环芳烃向少环方向迁移。

2.4 修复菌剂对土壤中微生物活性的影响

土壤中微生物的生长曲线见图4。由图4可见：添加无菌水菌悬液处理后的土壤样品中不同时间微生物生长曲线的变化趋势相近，停滞期相同，中段对数增长期的趋势相近[见图4(a)];而添加LB菌悬液处理后的土壤样品中生长曲线为多段式，表明微生物种类较为复杂[见图4(b)]。可见，微生物生长迟滞期随菌悬液处理时间的延长而缩短，生长速率随处理时间的延长而加快。由此说明，添加营养的菌悬液促进了土壤微生物的整体活性。

2.5 石油烃降解过程中微生物多样性的变化

将提取的菌液DNA进行ARISA序列分析，得到的检测结果见图5。一般来讲[12],每种微生物DNA长短(碱基对)是不同的，ARISA中可以分辨的荧光峰的大小，即基因片段的大小代表被分析样品中物种的种类，因此一种微生物会有一个特定的荧光峰。由图5可见，石油降解菌群中片段大小约550 bp的菌种占绝对优势，即为主要降解菌种。从菌种鉴定NCBI-Blastn比对结果可知，该菌种为假单胞杆菌属Pseudomonas。

土壤中添加降解菌群之前，土壤微生物多样性经ARISA分析的结果见图6。由图6可见，LB菌悬液处理前，在550 bp处没有明显的特征峰，说明试验所筛选出来的降解菌不是该土壤中原有的优势菌。

土壤中添加降解群之后，土壤微生物多样性经ARISA分析的结果见图7。由图7可见，当土壤中添加LB菌悬液后，在550 bp处出现了明显的特征峰，说明降解菌已接种至土壤中，且已成为优势菌之一；除此之外，LB菌悬液的加入也促使土壤中原有在260 bp、300 bp和370 bp处的三种菌也占据一定优势。

当土壤中添加LB菌悬液30 d后，其微生物群落结构发生了较大的变化，见图8。由图8可见，在550 bp处的降解菌特征峰仍然存在，但其优势已不再明显；土壤中原有的300 bp处的微生物特征峰已不明显，而在400 bp处出现了一个新的特征峰。这些结果表明，在该阶段土壤中优势菌已发生了改变。

2.6 石油烃降解过程中微生物功能基因的变化

表1中所列的D3、D5、D6、D7、C23均为海杆菌烷烃羟化酶基因的克隆PCR引物[22]，具有降解石油污染土壤中的海杆菌烷烃的特性。特异性引物GST为可降解芳香族化合物细菌中的谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆引物；特异性引物PD39为酚羟化酶大亚基基因的克隆PCR引物，其作用是降解石油污染土壤中酚羟物质，从而降低其污染程度。以上引物均可用于检测微生物在降解石油烃时降解基因表达的变化。

土壤DNA提取后经特异性引物D3、D5、D6、D7、GST、PD39、C23扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图9。由图9可见：土壤经LB菌悬液处理后0～49 d内，海杆菌烷烃降解基因D3一直以优势存在；PD39酚羟物质降解基因存在于处理0～15 d和49 d的土壤中，30 d时该基因片段消失，表明30 d时酚羟物质降解菌从优势菌转为非优势菌，49 d时再次转为优势菌。由此说明，土壤处理30 d以前微生物可能主要以烷烃降解过程中生成的醇类等物质为底物，而49 d后可能以芳香类降解过程中生成的酚羟类物质为底物。

3 结 论

本文以江汉油田石油污染修复场地中采集的石油污染土壤为研究对象，通过室内模拟修复试验，研究了土壤中石油烃与降解菌群的相互作用规律，得到如下结论：

(1) 在土壤中同时添加LB溶液与石油降解菌，能有效地促进石油烃的降解，同时增加了微生物的活性。但使用降解菌群进行石油烃污染土壤修复时，必须要考虑供给微生物生长繁殖所需的碳、氮、磷、钾等营养元素。

(2) 石油烃主要包含烷烃、芳烃以及其他组成成分，在对石油烃的作用过程中，低分子量有机物如短碳链和少环芳烃等较容易被降解，先发生作用，高分子量有机物较难降解，后发生作用，同时会慢慢转化为低分子量有机物。

(3) 通过对微生物多样性分析可知，LB菌悬液处理前后土壤中的微生物群落具有显著的差异，而且这种变化会随着反应时间的推移继续改变，通过检测到反应期间PD39酚羟物质降解基因的存在和消失，也能充分证明土壤中有机成分是影响微生物群落特征的重要因素。

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Research on Interaction between Petroleum Hydrocarbon and Degrading Bacteria Consortium in Soil

ZUO Limin1,2,MA Xiaoyang1,2,LI Zhimin3,YU Ronghua3,WANG Yan1,2, FENG Liang2,LIU Hui1,2,PENG Zhenghua3

(1.StateKeyLaboratoryofBiogeologyandEnvironmentalGeology,ChinaUniversityofGeosciences,Wuhan430074,China;2.SchoolofEnvironmentalStudies,ChinaUniversityofGeosciences,Wuhan430074,China;3.HubeiInstituteofHydrogeologyandEngineeringGeology,Jingzhou434020,China)

This paper takes the contaminated soil collected from the petroleum pollution repair site in jianghan oilfield as the research object and aims to study the interaction between petroleum hydrocarbon and microbes in soil through the indoor repair simulation experiment,which adds bacteria consortium to the oil-polluted soil and measures the content and composition of petroleum hydrocarbon,microbial activity and the diversity of microbes and functional genes in different processing time.The results show that petroleum hydrocarbon content decreases by 30% in 35 days in the soil treated with degrading bacteria consortium in LB media.Among the petroleum hydrocarbons,n-alkanes and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) with lower molecular weight decrease first,and then that with higher molecular weight degrades into smaller organic molecules.According to the results of DNA-ITS-PCR product analysis using ARISA,the degrading bacteria quickly becomes dominant species after entering into the soil.However,the microbial diversity changes much with culture time,and some new significant species appeare.The results of functional gene diversity showe that bacteria consortium mainly uses alcohols derived from the degradation of alkanes as substrate in the previous stage,and uses phenols-hydroxyls derived from the degradation of aromatic hydrocarbons as substrate.

petroleum-contaminated soil;biodegradation;biological activity;microbial diversity;functional gene diversity

1671-1556(2015)04-0063-06

2014-11-12

2015-04-03

国家国际科技合作专项项目(2013DFG92250)；资源枯竭型城市矿山地质环境治理重点工程项目(财建[2011]414号文)

左丽敏(1990—)，女，硕士研究生，主要研究方向为有机污染化学生物学。E-mail：784903064@qq.com

X53；X74

A

10.13578/j.cnki.issn.1671-1556.2015.04.011

刘 慧(1971—)，女，教授，博士生导师，主要从事环境有机化学生物学、污染场地修复、环境影响评价等方面的研究。E-mail:hliu2009@cug.edu.cn