新疆红肉苹果发育期间花青素代谢的研究

谢兵　周杰　朱树华

摘要：以新疆红肉苹果为试材，研究其生长发育过程中果肉花青素合成代谢的变化。结果表明：新疆红肉苹果果肉中的花青素含量从5月18日～6月11日逐渐减少，从7月5日～7月29日缓慢增长；在成熟的果实中，果肉花青素的含量是0.36 mg·g-1FW，高于普通品种的苹果，说明新疆红肉苹果是潜在的、良好的花青素来源；在新疆红肉苹果中，可溶性糖含量与类胡萝卜素含量呈显著负相关（R=-0.75），花青素含量与类胡萝卜素含量呈显著正相关（R=0.79），花青素含量与苯丙氨酸解氨酶（PAL）、花色素合成酶（ANS）之间没有明显的相关性，显示可能存在一些消耗花青素的途径。

关键词：新疆红肉苹果；花青素；叶绿素；类胡萝卜素；苯丙氨酸解氨酶；花色素合成酶

中图分类号：S661.101 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）08-0025-05

Abstract The changes of anthocyanin metabolism in Xinjiang red-flesh apple [Malus sieversii f. neidzwetzkyana（Dieck） Langenf.]were studied during fruit development. The anthocyanin content in flesh decreased gradually from May 18 to June 11， but increased slowly from July 5 to July 29. In mature fruits， the anthocyanin content was 0.36 mg·g-1FW， which were higher than that of common cultivars. It suggested that the Xinjiang red-flesh apple was a potential and good source of anthocyanin. There was significantly negative correlation （R=-0.75） between soluble sugar content and carotenoid content， and significantly positive correlation （R=0.79） between anthocyanin content and carotenoid content； no significant correlations were found between anthocyanin content and the activities of pheammonialyase （PAL） and anthocyanidin synthase （ANS）， which implied some pathways to consume anthocyanin.

Key words Xinjiang red-flesh apple；Anthocyanin； Chlorophyll； Carotenoid； PAL； ANS

新疆野苹果是第三纪孑遗物种，被认为是栽培苹果的祖先[1，2]。新疆红肉苹果是新疆野苹果的一种，果实和叶子中色素含量高，果皮和果肉在生长过程中和成熟后都保持着红色，被认为是重要的观赏和医用植物资源。花青素是一组天然色素，属于类黄酮，是很多水果呈现红蓝色的原因，在人类健康领域有着重要影响[3]。研究发现，摄入富含花青素的食物可以减少心血管疾病[4， 5]、癌症[6]、糖尿病[7]和其他慢性疾病[8]的发病率。

花青素的生物合成来源于苯丙烷的代谢，由一系列的酶反应步骤组成。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷合成路径的一个重要分支点，而花色素合成酶（ANS）能催化无色花色素向花青素转化。多项研究表明，PAL和ANS活性与花青素在苹果果实中的累积有着密切联系[9， 10]。然而，已有研究多集中在培育新疆野苹果上，关于花青素生物合成和新陈代谢的研究很少。本试验主要研究了花青素在新疆红肉苹果发育中的代谢情况，为新疆红肉苹果的开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用新疆红肉苹果均采自新疆石河子市。自5月18日（开花后2周）开始，至7月29日（近成熟）止，每12天采摘一次，每次采摘100个，共采摘7次。果肉经液氮处理后储藏在-80℃冰箱中，试验前研磨成细粉备用。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 花青素含量的测定 采用Rabino[11]和Xavier[12]等的方法测定。取100 g果肉细粉加入100 mL提取液（甲醇∶盐酸∶去离子水= 25∶5∶70，体积比），32℃、150 r·min-1匀浆24 h。将匀浆用6层纱布过滤，取滤液于4℃、12 000 r·min-1离心20 min，收集上清液，分别于525、657 nm测吸光度。花青素含量用公式（A525-0.25A657）/FW计算，以每单位鲜果质量的花青素含量表示，单位为mg·g-1FW。

1.2.2 叶绿素和类胡萝卜素含量的测定 采用Lichtenthaler[13]方法测定。取100 g果肉细粉用10～15 mL 95%乙醇和石英砂、碳酸钙萃取。匀浆用6层纱布过滤，取滤液于4℃、12 000 r·min-1离心20 min，收集上清，分别于665、649、470 nm测吸光度。叶绿素含量以每单位鲜果质量的叶绿素含量表示，类胡萝卜素含量以每单位鲜果质量的类胡萝卜素含量表示，单位均为mg·g-1FW。

1.2.3 可溶性糖含量的测定 采用Yemm等[14]的蒽酮比色法测定，取5 g果肉细粉加50 mL蒸馏水，封口膜封口，沸水浴1 h，然后10 000 r·min-1离心15 min，取0.5 mL上清液，加1.5 mL蒸馏水，测630 nm吸光度。endprint

1.2.4 PAL活性测定 采用Lister[15]方法测定。取50 g果肉样品细粉加入到50 mmol·L-1盐酸缓冲试剂（pH 7.0，含50 mmol·L-1抗坏血酸钠溶液，18 mmol·L-1巯基乙醇）60 mL中混匀。匀浆用6层纱布过滤，取滤液于4℃、12 000 r·min-1离心5 min。收集上清液，冰浴保存。

将17 mL提取液加入到等体积含11 mmol·L-1苯丙氨酸的反应液中，混匀，在34℃反应30 min，加入35%（w/v）三氟乙酸125 μL以停止反应。混合物于5 000 r·min-1离心5 min，取上清液在波长285 nm测其吸光度，平行测定3次。以每分钟A285增加0.01为一个酶活性单位（U）。PAL活性单位为U·g-1FW。

1.2.5 ANS活性测定 采用Nakajima等[16]的方法。取50 g果肉细粉加入20 mmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0，含200 mmol·L-1 NaCl，5 mmol·L-1二硫苏糖醇，10%甘油，4 mmol·L-1抗坏血酸钠）60 mL混匀。匀浆用6层纱布过滤，取滤液于4℃、12 000 r·min-1离心5 min。收集上清，冰浴保存。

取17 mL提取液加入到等体积含有0.1 mmol·L-1儿茶酸、0.4 mmol·L-1 FeSO4、1 mmol·L-1 2-酮戊二酸的反应液中，混匀，30℃反应1 h，加入34 μL浓盐酸终止反应。在520 nm测其吸光度，平行测定三次。以每分钟A520增加0.01为一个酶活性单位（U）。ANS活性单位表示为U·g-1FW。

2 结果与分析

2.1 花青素、叶绿素和类胡萝卜素含量

由图1可见，5月18日花青素含量为1.38 mg·g-1FW，7月29日花青素含量为0.36 mg·g-1FW，5月18日～6月11日，新疆红肉苹果花青素含量逐渐降低；6月11日～7月5日，花青素含量变幅较小；7月5日～7月29日，花青素含量逐渐升高。叶绿素含量在新疆红肉苹果生长过程中分别在6月11日和7月5日出现两个峰值，且数值持平，整体变化趋势呈“M”型。叶绿素与花青素含量变化呈相反趋势，当叶绿素含量达到两个峰值时，花青素含量都处于最小值。

5月18日～7月5日和7月5日～7月29日，新疆红肉苹果类胡萝卜素含量变化趋势相同，均为先降低后升高，且分别在6月11日和7月17日达到最小值。在收获果实前，类胡萝卜素含量缓慢增长。

2.2 可溶性糖含量

由图2可知，5月18日～7月5日和7月5日～7月29日，新疆红肉苹果可溶性糖含量均表现为先升高后降低的变化趋势，分别在6月11日和7月17日出现两个峰值，后者为前者的86%。

2.3 PAL活性

如图3所示，PAL活性在新疆红肉苹果的生长过程中表现不稳定。总体来看，PAL活性呈先降低后升高再降低的变化趋势，在5月30日时达到最小值，6月11日急剧增加到最大值，6月11日～7月29日，缓慢波动下降。之前报道中也出现过相似的结果，PAL活性在未成熟的果实中最高，随着生长逐渐下降，成熟时的活性将低于初始活性[15]。

2.4 ANS活性

如图3所示，5月18日～6月23日和6月23日～7月29日，新疆红肉苹果ANS活性均为先升高后降低的变化趋势，分别在6月11日和7月17日出现峰值。ANS最终活性略高于初始活性。

2.5 相关性分析

在新疆红肉苹果中，花青素含量与ANS、PAL活性之间相关性非常低；与可溶性糖和叶绿素含量之间相关不显著；但与类胡萝卜素含量呈显著正相关。类胡萝卜素含量与可溶性糖含量之间也有显著的负相关性，其余指标间则相关不显著。尽管显著性不高，花青素含量与叶绿素含量之间呈负相关，可溶性糖含量与ANS活性之间呈正相关（见表1）。

3 结论与讨论

新疆红肉苹果中花青素含量明显高于非新疆红肉苹果，Wu等[17]研究表明新疆红肉苹果中花青素含量为0.013～0.123 mg·g-1FW，高于非新疆红肉苹果Scugog苹果；Mazza等[18]测定的Scugog苹果中花青素含量为0.095～0.10 mg·g-1FW。与其他水果中花青素含量相比较，草莓[19]为1.20～1.71 mg·g-1FW，红葡萄[20]为0.069～0.15 mg·g-1FW，黑醋栗[21]为1.52～2.81 mg·g-1FW，黑莓[22]为1.26～1.52 mg·g-1FW，蓝莓[23]为0.25～4.95 mg·g-1FW。本研究发现，7月29日果实近成熟时花青素含量为0.36 mg·g-1FW，表明新疆红肉苹果具有成为食物和营养品中花青素来源的潜在价值。

花青素含量随新疆红肉苹果生长的变化与其它水果有很大区别。在大多数水果品种中，花青素含量随着果实生长而增加，如荔枝果皮[24]、欧洲甜樱桃[25]、纳瓦霍人黑莓[26]、红金苹果[27]、嘎啦苹果皮[28]等；且在大多数苹果品种中，果肉和果皮在未成熟果实中是不着色的，而是随着果实的逐渐成熟而着色。但在新疆红肉苹果中，果肉在刚结出果实的时候就已经是红色，因此在苹果发育初期，花青素含量很高。

在新疆红肉苹果发育早期（5月18日～6月23日），花青素含量减少，可能是因为花青素的抗氧化活性降低所致。据报道，花青素可以保护细胞免受氧化损伤[28]，在植物生长和环境改变的条件下，花青素经常出现积累瞬变——出现或消失[30]。花青素含量随着果实发育而减退已经在青椒中证实[31]。花青素还有光保护功能[32]，也可以抵抗感光氧化和紫外线的伤害[33]，Mohr等[34]表明花青素可以降低光损害水平，特别是能降低高能蓝色波长破坏原叶绿素。在新疆红肉苹果产地新疆，日光从5月份开始变得强烈，这正是叶绿素合成率高的一个阶段，花青素合成和降解可能是因为光的强度不同，以确保叶绿素的生物合成。花青素减少也可能是因为水果生长的稀释效应导致。endprint

在新疆红肉苹果中，类胡萝卜素和花青素参与果实的着色，且类胡萝卜素含量与花青素含量显著正相关，然而类胡萝卜素的橙色被花青素的颜色所掩盖。McGlasson[35]和Hiratsuka[36]等研究表明植物激素脱落酸促进花青素的生物合成。单一颜色的水果会提高植物激素脱落酸的应用，从而导致像葡萄皮[37]和樱桃皮[38]中花青素含量的增加。因此，在果实发育的早期阶段，类胡萝卜素的减少也可能是花青素含量降低的一个原因。在新疆红肉苹果发育后期，类胡萝卜素和花青素含量都逐渐累积。

已有研究表明，可溶性糖能刺激花青素的积累，如在拟南芥[40]、玉米[41]和葡萄[42]中。然而本研究发现，可溶性糖含量与花青素含量之间无明显的相关性，但与ANS活性之间呈正相关，分析可能是可溶性糖含量累积刺激ANS的活性。

本研究发现，当ANS活性较高时，叶绿素含量也较高，而花青素含量较低，反之亦然。分析可能是由于在叶绿素生物合成阶段，ANS活性处在较高的阶段，而花青素通过快速合成和降解来抵抗组织受到的光损伤，所以花青素含量明显处在较低水平。

在非新疆红肉苹果中，PAL活性的增长是对金冠苹果和绿苹果[43]的研究中发现的。PAL通常被认为是类黄酮生物合成中的主要限制因素[44]。然而，在本研究中发现，花青素含量和PAL活性之间没有明显的正相关性。分析原因可能是花青素只代表类黄酮化合物的一小部分，反馈抑制可能是关闭或减少酶活性的更有效的途径，也可能还存在其它消耗花青素的途径，同时来抵抗光损伤。

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