染色体计数法鉴定甘蔗真假热带种

王 平, 余 凡, 黄永吉, 陈胜烨, 经艳芬, 邓祖湖,3

(1.福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室，福建 福州 350002；2.云南省农业科学院甘蔗研究所瑞丽站，云南 瑞丽 678600；3.广西蔗糖产业协同创新中心，广西 南宁 530004)

染色体计数法鉴定甘蔗真假热带种

王 平1, 余 凡1, 黄永吉1, 陈胜烨1, 经艳芬2, 邓祖湖1,3

(1.福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室，福建 福州 350002；2.云南省农业科学院甘蔗研究所瑞丽站，云南 瑞丽 678600；3.广西蔗糖产业协同创新中心，广西 南宁 530004)

以甘蔗热带种中5个品种的根尖分生区细胞为研究对象，采用酶解去壁低渗法制片，使用显微镜直接观察法，分别统计染色体条数，旨在鉴别真假热带种。结果表明，供试材料中罗汉蔗和Badila染色体条数较为固定，2n=80条，为典型热带种；而50uahpele、Muckche和白眉蔗的染色体众数分别为86、142和104条，与典型热带种(2n=80条)有较大的偏差，由此表明该3个甘蔗品系为假热带种。

甘蔗; 热带种; 染色体; 品系

甘蔗不仅是重要的糖料作物，也是最有潜力的生物能源作物之一[1]。甘蔗属有6个原种，包括4个栽培种和2个野生种。栽培种包括热带种(Saccharumofficinarum)、中国种(S.sinense)、印度种(S.bareri)和肉质花穗野生种(S.edule)；野生种包括大茎野生种(S.robustum)和割手密(S.spontaneum)[2]。其中热带种是重要的栽培种之一。热带种被称为高贵种(noble cane)，大茎、叶片宽、含糖量高，在甘蔗育种上是高糖基因及高产基因的种源[3]，是甘蔗高贵化育种的回交亲本[4]。所谓高贵化(nobilization)就是以热带种为母本、其他野生种为父本，杂交得到的后代再连续与热带种回交的过程[5]。20世纪初，荷兰育种家Jeswiet首创甘蔗高贵化育种法，选育出了被誉为“一代蔗王”的POJ2878，产量、含糖率、抗性和适应性都十分优越，是全球甘蔗育种场使用最成功的育种亲本，当今绝大部分甘蔗栽培品种含有其血缘[6]。甘蔗真假热带种的鉴定对高贵化育种具有重要意义，主要体现在亲本选择方面。多年来，热带原种被广泛应用在甘蔗种质资源杂交利用中，通过远缘杂交获得大批杂交后代[7]，其抗逆性表现差异较大[8]。鉴定品种的方法较多，包括形态学鉴定和生理指标测定、细胞学鉴定、DNA分子标记、基因组原位杂交等方法。染色体是生物细胞内遗传物质的载体，每个物种都有一定数目及一定形态结构的染色体[9]。典型热带种染色体条数2n=80[10-11]，染色体基数x=10[12-13]。基于典型热带种染色体条数2n=80这一特征，通过染色体计数的细胞学方法甄别真假热带种直观有效。

1 材料与方法

1.1 材料

以罗汉蔗、Badila、50uahpele、Muckche和白眉蔗5种甘蔗根尖分生区细胞中期染色体为材料。其中，Badila来自福建农林大学甘蔗综合研究所；Muckche和罗汉蔗由云南省农业科学院甘蔗研究所提供；50uahpele和白眉蔗由云南省农业科学院甘蔗研究所瑞丽站提供。所有材料均保育在福建农林大学甘蔗综合研究所资源圃。

1.2 方法

1.2.1 染色体玻片的制备 采用酶解去壁低渗法[6,14]和涂片法[15]制备根尖分生区细胞染色体玻片。首先使用对二氯苯-α溴萘进行预处理，再用卡诺氏固定液4 ℃固定24 h，清洗干净后置于37 ℃酶解。酶解时间依据根的大小而定，一般为3-4 h。酶解前后用0.075 mol·L-1KCl和ddH2O各低渗30 min，涂片后使其自然干燥，并用pH值为6.8的Giemsa染液染色。

1.2.2 细胞染色体观察 使用Carl Zeiss显微镜观察染色体玻片。每种材料挑选30个染色体清晰且分散良好的中期分裂相细胞，利用AxioVision 4.7软件拍照，Image-Pro Plus 6.0软件统计染色体条数。

2 结果与分析

图1显示，5种甘蔗无性系材料的染色体背景比较干净、形态完整且分散良好。经统计，罗汉蔗和Badila染色体众数为：2n=80条(图1A、1B)，而50uahpele、Muckche和白眉蔗的染色体众数2n≠80条，其中50uahapele约86条、Muckche约142条、白眉蔗约104条(图1C、1D、1E)。本研究表明，Badila和罗汉蔗染色体条数较为固定，2n=80条，而其他3种材料的染色体2n>80条，且数目相差较大。在统计过程中，同种材料不同细胞的染色体数目有所波动(表1)，可能由于酶解或制片过程中出现染色体丢失和重叠的现象，因此需要观察多个细胞，取众数，有助于减小误差。

3 讨论与结论

现代甘蔗品种具有复杂的基因组结构，典型热带种染色体 2n=80条，主要包括拔地拉(Badila)、黑车里本(Cheribon Cane)、克里斯塔琳娜(Cristalina)、奥它希地(Otaheite)等[16]。本研究选用的罗汉蔗和Badila是典型热带种，尤其是Badila在甘蔗育种和制糖业历史中曾被广泛利用。我国主要甘蔗产业基地以Badila作为高贵化育种的起始亲本，选育了大批含割手密、大茎野生种和斑茅等野生种质血缘的崖城系列亲本[17]。Badila具有皮薄、质脆、纤维少和甘甜多汁的优良特性，使其在制糖业占有举足轻重的地位[18]。在实际甘蔗种植产业中，除了典型热带种之外，还存在一些非典型的热带种 (即某些种间杂种或有着未知的复杂血缘但分类学上又类似于高贵种的无性系)。Sobhakumari[19]报道，来自新几内亚岛的31个热带种无性系中，有29个典型热带种(2n=80条)，还出现了2个非典型的热带种NG 77-56和NG 77-26，它们的染色体条数分别为：2n=116、2n=70。Piperidis et al[20]通过基因组原位杂交技术研究甘蔗染色体组成和传递行为，结果表明，在其中5个非典型热带种(2n>80条)的染色体中检测到了割手密的血缘，说明它们属于杂种，进一步验证了之前认为超过80条染色体的无性系可能不是纯热带种的说法[21]。而且这种非典型热带种常有86和142条染色体[22]，本研究中50uahapele(2n≈86条)和Muckche(2n≈142条)染色体条数刚好与其相符，白眉蔗(2n≈104条)染色体条数也远远超过了80。严格意义的高贵化是指典型热带种与割手密杂交再连续与热带种回交的过程，热带种与割手密杂交F1和BC1多以2n+n的方式进行染色体遗传，但也出现过n+n、n+2n等不同的遗传方式[23-24]。若将假热带种误当作纯正热带种作为亲本进行杂交，则其杂交后代的染色体数目会出现较大变异，不利于遗传规律的分析。在甘蔗育种实践中，如用白眉蔗、Muckche、50uahapele这些掺入了其他血缘的假热带种当做典型热带种作为母本或回交亲本，将会延缓高贵化育种进程,而且不利于品种的改良。

品种细胞总数个染色体数目条染色体数目变化范围条变幅条罗汉蔗302n=80 80 0Badila302n=80 80 050uahapele302n=86 85-88 3Muckche302n=142141-1432白眉蔗302n=104104-1062

本研究通过染色体计数确定50uahapele、Muckche和白眉蔗是假热带种。染色体计数法可为甘蔗热带种的鉴别提供技术支持，从而为甘蔗高贵化育种杂交亲本的选择提供借鉴，提高育种效率。

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(责任编辑:陈幼玉)

Determination of authenticity ofSaccharumofficinarumclones by chromosome numbers

WANG Ping1, YU Fan1, HUANG Yong-ji1, CHEN Sheng-ye1, JING Yan-fen3, DENG Zu-hu1,2

(1.Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.Ruili Breeding Station, Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Ruili, Yunnan 678600, China; 3.Guangxi Collaborative Innovation Center of Sugarcane Industry, Nanning, Guangxi 530004, China)

To determine the authenticity of fiveSaccharumofficinarumclones, fast growing root tip cells were collected. The cells were treated with enzymatic hydrolysis of low permeability, mounted on a glass slide, and observe under a microscope to count the number of metaphase chromosomes. The results showed that the chromosome numbers varied from 80 to 143. Two clones, Luohanzhe and Badila, had 2n=80 chromosomes and were trueS.officinarumspecies. Whereas the chromosome numbers of 50uachapele, Muckche and Baimeizhe were varied with average number of 2n=86, 142 and 104, respectively. The deviation from the typical 2n=80 chromosome number forS.officinarumclearly suggested that these three tropicalSaccharumclones were notS.officinarumclones.

sugarcane;Saccharumofficinarum; chromosome; clone

2015-07-10

国家甘蔗产业体系专项资金(CARS-20-1-5)；国家科学青年基金(31401440)资助项目。

王平(1989 - )，硕士研究生。研究方向：甘蔗遗传育种。Email：wangping629357@163.com。通讯作者邓祖湖(1969-)，研究员，博士。研究方向：甘蔗遗传育种。Email：dengzuhu@163.com。

S566.1

A

1673-0925(2015)03-0160-04

10.13321/j.cnki.subtrop.agric.res.2015.03.004