吉林汉族人群ERAP1基因3′UTR单核苷酸多态性与原发性高血压的关联性分析

杨四宝，刘雪岩，李　冰，丁　梅，贺玉泉，杨　萍

(吉林大学中日联谊医院心内科， 吉林 长春 130033)

吉林汉族人群ERAP1基因3′UTR单核苷酸多态性与原发性高血压的关联性分析

杨四宝，刘雪岩，李冰，丁梅，贺玉泉，杨萍

(吉林大学中日联谊医院心内科， 吉林 长春 130033)

目的：探讨ERAP1基因在高血压患者外周血中的表达，鉴定ERAP1基因3′UTR区与原发性高血压有关联的候选单核苷酸多态性(SNPs)位点。方法：在吉林地区汉族人群中选取高血压患者300例(高血压组)及正常对照者233名(对照组)进行病例对照研究，采用ELISA法检测研究对象的外周血中ERAP1表达水平，混池测序法鉴定ERAP1基因 3′UTR区SNPs位点，采用PCR测序的方法对研究对象进行测序分型。结果：高血压组患者外周血中ERAP1表达水平明显低于对照组 (P<0.05)；ERAP1基因 3′UTR区鉴定出2个SNPs位点E20-790G>A和E20-816C>T，E20-816C>T位点的等位基因及基因型频数分布在高血压组和对照组间差异有统计学意义(P<0.05);排除混杂因素后，Logistic回归分析，E20-816C>T位点CT基因型频数在高血压组中显著降低(P<0.05，OR=0.145，95% CI: 0.031-0.675)。结论：在吉林地区汉族人群中，ERAP1基因E20-816C>T位点多态性可能与原发性高血压有关联，高血压中CT基因型频数的降低可能与ERAP1表达下调有关联。

原发性高血压;内质网氨基肽酶1;单核苷酸多态性;分子遗传学;关联研究

原发性高血压是一种遗传因素和环境因素相互作用所致的疾病，流行病学研究[1]表明：30%～40%的血压变化是由基因引起的，因此分子遗传学研究在高血压的治疗中有望发挥关键作用。本课题组前期进行了高血压患者和正常人外周血芯片基因差异表达分析[2]，鉴定出31个表达上调和18个表达下调的基因，其中高血压患者中内质网氨基肽酶1(endoplasmic reticulum aminopeptidase 1，ERAP1)基因表达水平是正常人的0.46倍，其表达水平明显下调。ERAP1是锌金属肽酶M1家族中的一个多功能酶，能水解多种生物活性肽[3]。ERAP1 和 ERAP2 可通过影响肾素-血管紧张素系统在血压调节中发挥作用，ERAP1 可有效将血管紧张素Ⅱ 剪切为血管紧张素Ⅲ 和Ⅳ，而ERAP2则可将血管紧张素Ⅲ剪切为 IV[4]，在相同的系统内，2种酶均可将激肽转化为缓激肽[5]。ERAP1是具有高度多态性的基因，其天然存在的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与很多疾病的发生发展有关联[6-8]。在与原发性高血压的关联研究中，Yamamoto等[9]发现：ERAP1基因Lys528Arg SNP位点与原发性高血压有关联，并推测Lys528Arg位点突变型ERAP1酶活性低于野生型。3′非翻译区(3′ untranslated region,3′UTR)可通过影响mRNA的稳定性和蛋白表达水平在转录后调控中发挥重要作用，一些基因的3′UTR区多态性被证实与原发性高血压患病风险有关联[10-12]。因此本课题组首先对高血压患者和正常血压对照者进行外周血ERAP1检测，验证高血压患者的ERAP1表达水平是否下调；同时选择ERAP1基因3′UTR区的SNPs位点为研究对象，在中国东北地区汉族人群中进行病例对照研究，鉴定ERAP1基因是否为原发性高血压的易感基因，为高血压的分子遗传学研究提供依据。

1　材料与方法

1.1一般资料选择2014年4月于吉林大学中日联谊医院体检中心进行体检的吉林地区汉族人533名，年龄25～69岁，测量身高、体质量、体质量指数 (body mass index,BMI)、心率(heart rate,HR)、收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、快速血糖(fast blood glucose,FBG)、甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、尿酸(uric acid,UA)和血清肌酐(serum creatinine,SCr)水平。血压由心脏病专家根据欧洲高血压协会推荐的通用方案进行2次测量[13]，中间间隔5 min。高血压组纳入标准：平均收缩压(mean systolic pressure,MSP)≥ 140 mmHg 和/或平均舒张压(mean diastolic pressure,MDP)≥90 mmHg，或自述正在服用抗高血压药物。对照组纳入标准：MSP<140 mmHg和MDP<90 mmHg，且从未进行过降压治疗。排除标准： 继发性高血压患者;有原发性肾脏疾病者;有内分泌疾病者。最终入选原发性高血压患者300例，正常血压对照者233名。BMI = 体质量(kg)/身高2(m2)；每位参与者均进行问卷调查，调查内容包括吸烟及饮酒情况，每年吸烟≥100支或饮酒≥12次定义为吸烟者或饮酒者[14-15]。本研究符合赫尔辛基宣言,获吉林大学中日联谊医院伦理委员会批准，所有参与者均获取知情同意，并签署试验知情同意书。

1.2研究对象外周血中ERAP1表达水平测定及基因分型随机抽取42例高血压患者和34例对照者的血样，采用促凝试管收集，离心获取血清于-80℃保存，根据人类ERAP1 Elisa检测试剂盒(IBL公司,Germany)说明书进行外周血ERAP1水平检测。其余258例高血压患者和199名正常对照者血样用EDTA抗凝试管收集并储存于-20℃，采用AxyPrep (Axygen Scientific公司,USA)全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA，其中随机选取100个DNA样本分成5个混池，每个混池20个DNA样本，分别对ERAP1的3′UTR区进行PCR扩增及测序分析，测序反应由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。采用DNAStar序列比对软件分析并识别DNA序列变异，筛选出2个SNPs位点，进一步通过测序的方法对所有样本PCR纯化产物进行基因分型，PCR反应上游引物：5′-AATCATCAGTCTCGGCTCTTCTG-3′ ，下游引物：5′ -TGTAAACAAACCGTGGAACTCTAAG -3′；RCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；4℃保存。

2　结　果

2.1研究对象的临床资料和外周血中ERAP1表达水平高血压组研究对象外周血中ERAP1表达水平明显低于对照组(P<0.05)；高血压组和对照组研究对象外周血中ERAP1表达水平及临床资料见表1。用于ERAP1 3′UTR区基因分型的457名无血缘关系的参与者中有258例高血压患者和199名正常血压对照者，其中吸烟史和饮酒史的调查有部分数据缺失，吸烟史纳入研究对象284名(对照组129名，高血压组155名)；饮酒史纳入研究对象282名(对照组129名，高血压组153名)，其临床资料见表2，除血压水平，用于ERAP1 3′UTR基因分型研究的2组研究对象的性别构成、年龄、吸烟史、饮酒史、TG、TC、FBG、BUN和BMI比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

表1　研究对象临床资料和外周血中ERAP1表达水平

2.22组研究对象的SNPs通过对ERAP1 3′UTR区混池测序，鉴定出E20-790G>A和E20-816C>T 2个SNPs位点，其分别与NCBI标签rs2290678和rs1953298对应，2个多态性位点的鉴定结果见图1和2。E20-790G>A和E20-816C>T只有2种基因型，其最小等位基因频数(minor allelic frequency，MAF)分别是0.012 和0.025，高血压组和对照组研究对象2个SNPs位点等位基因和基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。

2.3SNPs与高血压的关联分析高血压组与对照组研究对象E20-816C>T位点的基因型和等位基因频数分布比较差异均有统计学意义(P<0.05)，突变基因型CT及突变碱基T在高血压患者中出现的频率显著低于对照组；携带E20-816C者大多舒张压较低。2组研究对象E20-790G>A位点的基因型及等位基因频数分布比较差异均无统计学意义(P>0.05)，携带突变基因型GA者对应的SBP及DBP水平均较高。E20-790G>A 和 E20-816C>T 2个多态性位点的基因型和等位基因频数以及不同基因型研究对象的平均SBP和DBP水平见表3和4。

表2　用于ERAP1 3′UTR基因分型研究对象的临床资料

A: GG;B: GA.

Fig.1Identification diagram of sequencing for E20-790G>A SNPs sites

A: CC;B: CT;Arrow: SNP sites.

Fig.2Identification diagram of sequencing for E20-816C>T SNPs sites

表32组研究对象的ERAP1基因E20-790G>A和E20-816C>T位点基因型和等位基因频数分布

Tab.3Distribution of genotypic and allelic frequencies at E20-790G>A and E20-816C>T sites of ERAP1 gene of objects in two groups

GroupnGenotypicfrequencyofE20-790G>AGGGAPAllelicfrequencyofE20-790G>AGAPControlHypertension258199195(98.5)250(96.9)3(1.5)8(3.1)0.274393(99.2)508(98.4)3(0.8)8(1.6)0.277GroupnGenotypicfrequencyofE20-816C>TCCCTPAllelicfrequencyofE20-816C>TCTPControlHypertension199258183(92.4)250(96.9)15(7.6)8(3.1)0.030381(96.2)508(98.4)15(3.8)8(1.6)0.033

排除混杂因素(包括年龄、性别、BMI、TC、TG、FBG、吸烟和饮酒习惯等)作用之后进行逻辑回归分析结果显示：E20-816C>T位点的CT基因型频率在高血压组中显著降低(P=0.014，OR=0.145，95% CI: 0.031-0.675)，携带T等位基因的人群患高血压的风险显著降低，表明T等位基因可能是中国东北汉族人群患高血压的一个保护因素。E20-790G>A位点未发现其与高血压的关联性。见表5。

表4　研究对象血压与E20-790G>A和E20-816C>T 位点基因型的关系

表5ERAP1基因E20-790G>A 和 E20-816C>T位点基因型与原发性高血压的Logistic回归分析

Tab.5Logistic regression analysis of association between genotypes of E20-790G>A and E20-816C>T sites and essential hypertension

SiteContrastOR95%CIPE20-790G>AGG∶GA1.8530.335-10.2500.480E20-816C>TCC∶CT0.1450.031-0.6750.014

3　讨　论

本研究验证了在高血压患者外周血中ERAP1呈低表达，这与本课题组Korkor等[2]的芯片表达及定量验证研究结果一致，表明ERAP1表达水平下降与高血压患病风险增加有关联。本研究通过测序的方法在ERAP1基因的3′UTR区鉴定出2个SNP位点，并分别对这2个位点进行基因分型；关联分析结果显示：ERAP1基因的E20-816C>T多态性位点在中国东北汉族人群中与原发性高血压有关联，等位基因T可能是原发性高血压的保护因素，可以作为原发性高血压风险预测的分子标记。

ERAP1通过降解AngⅡ和生成缓激肽参与血压调节，其外显子多态性经证实与酶活性有关联。Yamamoto等[9]通过对人类ERAP1基因33个外显子多态性位点的筛选，发现Lys528Arg多态性位点与原发性高血压有关联，并推测Lys528Arg位点突变型ERAP1酶活性比野生型降低。随后，Hallberg等[16]提出该多态位点决定了高血压和左室肥厚患者在抗压治疗过程中左室肥厚的程度。为了验证这一假说，Goto等[17-19]比较了野生型、Lys528Arg突变型和其他突变型的酶活性，结果显示：在检测的非同义多态性位点中，仅Lys528Arg突变体酶活性降低，表明其观察到的关联性确实是由于酶活性降低引起的；进一步分子模拟研究显示Lys528位于酶底物袋附近，对于形成和保持酶底物袋非常重要。以上研究证实了ERAP1基因在血压调节中的负性作用，而本文作者发现：原发性高血压患者外周血中ERAP1表达水平显著下调，与以上研究结果一致。

3′UTR区在真核生物转录后调控中发挥重要作用。真核生物mRNA降解有2种途径: 一些mRNA分子的3′UTR的特殊序列有助于特殊蛋白质的结合，增加或降低poly(A)缩短的速度；mRNA降解的另一个途径始于特殊内切酶的作用，可将poly(A)直接从mRNA分子上切除，这种切除也有赖于mRNA分子的3′UTR特殊序列可以被内切酶识别。3′UTR还可通过与特定微小RNAs(microRNAs)相互作用，导致其mRNA降解或者翻译抑制使mRNA及其相应基因无法表达而沉默。此外，一些转录抑制蛋白能识别特殊mRNA分子的3′UTR，通过干扰3′poly(A)尾与5′端帽的联络而减少翻译的启动。本研究结果显示：在ERAP1基因3′UTR区的2个SNPs位点中，E20-816 C>T多态性位点与原发性高血压有关联，推测可能与ERAP1表达水平降低有关。

本研究首次在中国吉林汉族人群中探讨E20-790G>A 和 E20-816C>T多态性位点与原发性高血压的关联性，但尚存在一定的局限性。首先，由于样本量的限制，790G>A和816C>T多态性位点与原发性高血压的相关性不能进行深入的亚组分析；其次，检测E20-790G>A 和 E20-816C>T位点各基因型间ERAP1基因的表达水平，分析不同基因型ERAP1表达水平的差异，可能帮助解释ERAP1在高血压患者中表达水平降低的原因；最后，原发性高血压发病中ERAP1表达水平降低的作用机制需要借助细胞及动物模型深入探讨。在后续的研究中，本课题组将着重研究ERAP1在E20-816C>T多态性位点不同基因型之间表达的差异，以及ERAP1表达水平降低在原发性高血压发病机制中的作用，为原发性高血压的基因诊断及个体化治疗提供分子遗传学依据。

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Association between single nucleotide polymorphisms in 3′UTR of ERAP1 gene and essential hypertension in Jilin Han population

YANG Sibao,LIU Xueyan,LI Bing,DING Mei,HE Yuquan,YANG Ping

(Department of Cardiology,China-Japan Union Hospital,Jilin University,Changchun 130033,China)

ObjectiveTo explore the expression levels of ERAP1 gene in the peripheral blood of the essential hypertension patients, and to identify the single nucleotide polymorphisms(SNPs) in 3′UTR of ERAP1 gene associated with essential hypertension. Methods300 patients with hypertension (hypertension group) and 233 normal controls (control group) were recruited to conduct a case-control study in Jilin Han population. The expression levels of ERAP1 in the peripheral blood of the objects were detected by ELISA method;the SNPs in 3′ UTR of ERAP1 gene were identified by pool-sequencing method;the genotyping was performed for each participant by PCR sequencing method. Results The expression levels of ERAP1 in the peripheral blood of the patients in hypertension group were significantly lower than those in control group (P<0.05). Two SNPs,E20-790G>A and E20-816C>T,were identified in 3′UTR of ERAP1 gene. The distribution of the genotypic and allelic frequencies of E20-816C>T polymorphism was significantly different between hypertension group and control group (P<0.05). The Logistic regression results showed that adjusting for the confounding factors,the genotypic frequency of CT gene in hypertension group was decreased significantly(P<0.05，OR=0.145，95% CI: 0.031-0.675). Conclusion E20-816C>T polymorphism may be related to essential hypertension in the Jilin Han population,and the decreasing genotypic frequency of CT gene may be related to the down-regulated expression of ERAP1.

essential hypertension;endoplasmic reticulum aminopeptidase 1;single nucleotide polymorphism;molecular genetics;association study

1671-587Ⅹ(2015)02-0383-06

10.13481/j.1671-587x.20150235

2014-09-25

国家自然科学基金资助课题(81270315)；吉林省科技厅重点科技攻关项目资助课题(20140204016SF)

杨四宝(1987-)，女，河北省沧州市人，在读医学博士，主要从事高血压及心衰的表观遗传学方面的研究。

杨萍，教授，博士研究生导师(Tel：0431-84995091，E-mail：pyang@jlu.edu.cn)

R544.11

A