替莫唑胺联合二甲双胍对胶质瘤干细胞的清除作用及其机制

余志云，李蕴潜，陈　勇，赵丽艳，刘焕兵，王　楠，王　斌，陈云照，赵　刚

(1. 吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021；2. 吉林大学第一医院检验科，吉林 长春 130021)

替莫唑胺联合二甲双胍对胶质瘤干细胞的清除作用及其机制

余志云1，李蕴潜1，陈勇1，赵丽艳2，刘焕兵1，王楠1，王斌1，陈云照1，赵刚1

(1. 吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021；2. 吉林大学第一医院检验科，吉林 长春 130021)

目的：探讨替莫唑胺(TMZ)联合二甲双胍(MET)对体外胶质瘤干细胞(GSCs)的清除作用，探讨其作用机制。方法：神经干细胞培养基培养人胶质瘤U87细胞，免疫荧光法鉴定GSCs。收集GSCs，以对照液、不同浓度TMZ、MET和TMZ+MET作用细胞，分为对照组、TMZ组、MET组和TMZ+MET组。显微镜下计数各组二次神经球的数量；CCK-8法检测各组GSCs增殖抑制率；流式细胞术和Annexin-PI双染流式细胞术检测GSCs各细胞周期百分比和凋亡率。结果：与对照组比较，TMZ+MET组二次神经球数量以浓度依赖的方式减少；与TMZ和MET组比较，TMZ+EMT组二次神经球数量明显减少(P<0.01)。与对照组比较，TMZ和MET组GSCs增殖抑制率升高；TMZ+MET组GSCs增殖抑制率高于TMZ或MET组，联合指数(CI)小于1。流式细胞术，与TMZ和MET组比较，TMZ+MET组G2/M期GSCs百分比明显升高(P<0.05)；TMZ+MET组GSCs凋亡率明显高于TMZ和MET组(P<0.05)。结论：TMZ联合MET在体外能抑制GSCs的连续自我更新能力并清除GSCs,其机制可能与阻滞GSCs细胞周期进展和诱导细胞凋亡有关联。

替莫唑胺；二甲双胍；胶质瘤干细胞；自我更新

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，目前标准治疗方案包括手术和术后放化疗。由于胶质瘤细胞向周围组织的侵袭性生长，手术难以彻底切除肿瘤，多数患者术后复发，预后不良[1]。化疗是胶质瘤重要的辅助治疗手段。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是目前治疗恶性胶质瘤最重要的一线化疗药物，尽管在胶质瘤治疗中取得一定疗效，但对恶性胶质瘤的有效率不足45%，患者长期生存率仍然很低[2]，因此如何提高TMZ的疗效是亟待解决的问题。近年从人类胶质母细胞瘤组织及胶质瘤细胞系中分离得到了胶质瘤干细胞(glioblastoma stem cells,GSCs)，或称为胶质瘤干细胞样细胞(glioblastoma stem-like cells)[3]。GSCs在胶质瘤的发生发展、耐药和复发中起关键作用，已成为治疗的重要新靶点[3-4]。近年多项研究[5]证明二甲双胍(metformin,MET)能选择性靶向并杀灭多种肿瘤干细胞，阻抑其自我更新和体内成瘤能力。虽然已有研究[3]证明TMZ治疗后胶质瘤再生长的细胞来源是GSCs，高浓度TMZ能选择性杀灭GSCs，然而有关MET与TMZ联合应用对GSCs影响目前尚未见报道。本研究观察TMZ联合MET对GSCs自我更新、增殖、周期和凋亡的影响，为探讨有效且临床实用的胶质瘤化疗策略提供实验依据。

1　材料与方法

1.1细胞和主要试剂人恶性胶质瘤U87细胞购自南京凯基生物公司。DMEM培养基、Neurobasal培养基(NBM)、B27、N2、glutaMAX、肝素和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；胎牛血清(fetal calf serum，FBS)、青霉素、链霉素和谷氨酰胺购自美国Hyclone公司；重组人碱性成纤维生长因子(recombinant human FGF-basic，bFGF)、重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor，EGF)购自美国PeproTech公司；多聚赖氨酸、牛血清白蛋白(bull serum albumin，BSA)、Accutase消化液、TMZ和MET购自美国Sigma公司；GSCs表面标记物兔抗人CD133单抗、小鼠抗人Nestin单抗、GSCs分化标志物兔抗人胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)多抗、鼠抗人β微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)多抗、DAPI和FITC标记的山羊抗兔及PE标记的兔抗小鼠二抗购自北京中杉金桥公司；CCK-8细胞增殖试剂盒购自碧云天公司；膜联蛋白(Annexin V)和碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2细胞培养及传代将U87细胞接种于DMEM培养基(含10%FBS，100 U·mL-1青-链霉素，2 mmol·L-1谷氨酰胺)，置于37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内培养。将处于对数生长期的U87细胞用胰酶消化后，接种于NBM完全培养基(含1×B27，1×N2，1×glutaMAX，2 mg·L-1肝素，20 μg·L-1bFGF，20 μg·L-1EGF，100 U·mL-1青-链霉素)，置于37℃、5% CO2饱和湿度孵箱内培养。每2～3 d换液1次并添加新鲜EGF和bFGF，待悬浮生长的神经球直径达到200～300 μm时，用Accutase消化液将神经球消化成单个细胞，按1∶2或1∶3比例传代。

1.3CSCs的鉴定将收集的神经球接种于无菌多聚赖氨酸包被的载玻片上，加入10%FBS继续培养8 h，待贴壁牢固后，以4%多聚甲醛固定30 min，0.1%Triton X-100孵育，5%BSA封闭。加入兔抗人CD133单抗、小鼠抗人Nestin单抗、兔抗人GFAP和鼠抗人β-tubulinⅢ，4℃孵育过夜后，分别加入FITC标记的山羊抗兔二抗及PE标记的兔抗小鼠二抗，常温下孵育1 h，最后用DAPI染核5 min，0.01 mol·L-1PBS洗3次，荧光共聚焦显微镜下观察GSCs表面标志物的表达情况。为了鉴定GSCs的多向分化潜能，将神经球接种至含10%FBS的DMEM培养基中继续培养7 d，然后按上述方法染色，荧光共聚焦显微镜下观察GSCs分化标志物的表达情况。

1.4二次神经球形成数量的检测收集形成的原代神经球，用Accutase消化液消化分散为单个细胞后，按5×103接种于96孔板，NBM完全培养基中培养，设对照组(不加TMZ和MET)，其他各组分别加入不同浓度TMZ(0.1、0.2、0.4和0.8 mmol·L-1)、MET(5、10、20和40 mmol·L-1)和同样剂量TMZ+MET处理细胞，分别为TMZ、MET和TMZ+MET组，每2 d补充NBM完全培养基0.02 mL。7 d后倒置显微镜下计数悬浮生长的二次神经球形成的数量。

1.5细胞增殖实验收集生长良好的神经球，用Accutase消化液消化分散后，按5×103接种于96孔板，NBM完全培养基中培养。同步化培养24 h后，设对照组(不加TMZ+MET)，其他各组分别加入TMZ(0.025～3.200 mmol·L-1)或MET(1.25～160.00 mmol·L-1)，作用69 h，加入10%CCK-8试剂再孵育3 h后，酶标仪测450 nm波长处的吸光度(A450)值。同时进行另一组平行对照实验，即TMZ和MET按上述药物浓度以1∶50的比例处理GSCs。应用CalcuSyn软件(Biosoft,英国)计算两药联合指数(combination index,CI)[6]。如果CI<1，提示有协同作用；CI=1，提示相加作用；CI>1，提示拮抗作用[6]。

1.6细胞周期百分比检测同步化培养的GSCs经不同因素(不含TMZ和MET的DMSO对照液、0.4 mmol·L-1TMZ、20 mmol·L-1MET和TMZ+MET)处理48 h后(分别为对照组、TMZ组、MET组和TMZ+MET组)，收集细胞，PBS洗涤2次，悬浮于预冷的70%酒精-20℃固定过夜。重悬细胞于PBS中，加入100 mg·L-1RNA酶37℃孵育30 min，然后加入100 mg·L-1PI避光继续37℃孵育30 min，采用流式细胞术检测细胞G0、G0/G1、S、G2/M期百分比，采用ModFit LT 3.3 软件进行数据分析。

1.7Annexin-PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率同步化培养的GSCs经不同因素(不含TMZ和MET的DMSO对照液、0.4 mmol·L-1TMZ、20 mmol·L-1MET及TMZ+MET)处理48 h(分别为对照组、TMZ组、MET组和TMZ+MET组)，收集细胞，按凋亡试剂盒说明书处理细胞后，Annexin-PI双染流式细胞术检测正常、早期和晚期细胞的凋亡率，采用FACSDiva 6.2软件进行数据分析。

2　结　果

2.1神经球形成和GSCs的鉴定人胶质瘤U87细胞接种到NBM培养基后，3～4 d开始形成神经球，约1周神经球体积明显增大，每个神经球约含100～200个神经细胞。将初代神经球消化分散成单个细胞后，再置于完全NBM培养基中培养，均能形成2代神经球，说明这些细胞具有自我更新能力。神经球能表达GSCs的表面标志物CD133(图1 A～C,见插页五)和Nestin(图1 D～F,见插页五)，基本不表达星形细胞标记物GFAP和神经元标记物β-TubulinⅢ，表明这些细胞是未分化的GSCs。神经球转移到含10%FBS的DMEM培养基中培养3～4 d即可见细胞呈明显分化状态，约7 d时与正常培养U87细胞的形态无明显区别，多数细胞表达GFAP，部分细胞表达β-TubulinⅢ(图1 G和H，见插页五)，而极少数细胞表达CD133和Nestin。

2.2各组二次神经球形成数量将原代形成的神经球消化分散为单个细胞后，分别加入不同浓度TMZ和MET，随着药物浓度的提高，二次神经球形成的数量明显减少(P<0.05)，神经球的体积也较对照组明显缩小。TMZ+MET组二次神经球形成数量少于各单药组(P<0.05)，见表1。

表1各组二次神经球数量

GroupDose(mmol·L-1)No.ofneurosphereControl0.0151±5 TMZ0.198±3*0.246±3*0.415±2*0.80±0*MET5.090±4*10.040±2*20.012±1*40.0 0±0*TMZ+MET0.1+5.040±4*0.2+10.020±3*0.4+20.0 3±1*0.8+40.0 0±0*

*P<0.05 compared with control group.

2.3各组GSCs增殖抑制曲线TMZ(0.025～3.200 mmol·L-1)或MET(1.25～160.00 mmol·L-1)单药对GSCs增殖有抑制作用，且随着药物浓度的升高而增强。TMZ与MET联合应用对GSCs增殖的抑制作用明显强于对照组，TMZ+MET组CI小于1，表明TMZ与MET联合应用能协同抑制GSCs增殖。见图2。

2.4各组GSCs细胞周期百分比与对照组比较，TMZ主要使GSCs阻滞在G2/M期，MET也可GSCs处于G2/M期百分比有所升高；与TMZ组或MET组比较，TMZ+MET组GSCs阻滞在G2/M期百分比显著升高(P<0.05)。见图3(插页五)和表2。

图2　各组GSCs增殖抑制曲线

Fig.2Curves of proliferation inhibition of GSCs in various groups

表2　各组GSCs细胞周期的百分比

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with TMZ group;#P<0.05 compared with MET group.

2.5各组GSCs凋亡率Annexin-PI双染流式细胞术检测，与TMZ和MET组比较，TMZ+MET组GSCs凋亡率明显升高(P<0.05)，表明TMZ与MET联合应用能诱导GSCs凋亡，作用明显强于TMZ组和MET组。见图4和表3。

3　讨　论

肿瘤干细胞理论认为：肿瘤干细胞不仅在肿瘤起动和进展中起决定性作用，也是导致肿瘤转移、复发和常规治疗抵抗的根源。因此，靶向清除肿瘤干细胞已成为根治肿瘤的关键。GSCs是恶性胶质瘤组织中数量很少的特殊细胞，具有自我更新、多向分化、体内成瘤能力和对化放疗高度耐受等特点，在胶质瘤的发生发展、耐药及复发中起着决定性作用[3-5]，因此清除GSCs可能从源头上遏制胶质瘤细胞增殖，为根治胶质瘤提供新的策略。

A:Control group；B:TMZ group；C:MET group；D:TMZ+MET group.

GroupLateapoptoticrate/necrosisEarlyapoptoticrateControl1.16±0.0314.7±1.02TMZ1.44±0.0530.4±2.03*MET3.73±1.2024.5±1.31*TMZ+MET6.23±0.94*△55.5±2.58*△#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with TMZ group;#P<0.05 compared with MET group.

CD133和Nestin是GSCs最重要的表面标记物[7]。本实验采用无血清培养法，从人胶质瘤U87细胞中成功分离出CD133+及Nestin+神经球，这些细胞基本不表达星形细胞标记物GFAP和神经元标记物β-TubulinⅢ，表明本实验分离的细胞是未分化的GSCs。将神经球转移到含血清的培养基中培养后，又可见细胞呈分化状态，这符合肿瘤干细胞的一般特点。

肿瘤干细胞的自我更新是指在每一次分裂时均能产生至少1个相同特征的子代肿瘤干细胞。自我更新能力是肿瘤干细胞的重要特性之一，对维持肿瘤干细胞的数量起关键作用，因此检测自我更新能力已成为鉴定肿瘤干细胞的一个重要指标[8]。在体外无血清悬浮培养条件下神经球形成实验是检测肿瘤干细胞自我更新能力的经典方法[9]。在本研究中，将人胶质瘤U87细胞接种到NBM培养基悬浮培养后形成神经球，神经球体积逐渐增大，每个神经球约含100～200个细胞，说明这些神经球细胞具有自我更新能力；原代形成神经球消化分散成单个细胞后，再置于NBM培养基中培养，能形成2代神经球，进一步说明这些细胞具有明显的自我更新能力[10-11]；将原代神经球消化分散为单个细胞，经TMZ与MET联合处理后形成神经球的数量明显减少，球的体积明显缩小，其作用较TMZ或MET单药更为明显，表明TMZ与MET联合应用能显著抑制GSCs的连续自我更新能力，显示出明显清除GSCs的作用。当然，欲验证TMZ与MET联合应用对GSCs的清除效果，还必须在免疫抑制小鼠体内进行成瘤试验及再成瘤试验[11]。Soritau等[12]选取8例手术切除的高级别胶质瘤肿瘤标本，从中分离培养肿瘤细胞并用MET和(或)TMZ处理，结果显示：与单用TMZ比较，MET与TMZ联合使用能更明显抑制肿瘤细胞增殖，这一结果为本课题深入研究TMZ联合MET的抗胶质瘤效应提供了线索。

本研究结果表明：TMZ与MET联合应用能明显抑制GSCs增殖，其作用明显强于TMZ或MET单药，两药联合的CI<1，表明两药联合应用能协同抑制GSCs增殖。虽然本研究证明TMZ联合MET能协同抑制GSCs增殖，但通过何种机制发挥这种作用尚不清楚。本研究证明TMZ与MET联合处理能明显增强对GSCs 的G2/M期的阻滞作用，并诱导GSCs凋亡，这可能是TMZ联合MET抑制GSCs增殖的可能机制。

有关TMZ与MET联合应用对GSCs的清除作用及其机制目前研究较少。有研究[13]表明：TMZ可以杀灭胶质母细胞瘤中GSCs，但后来的研究并未肯定这一作用。因此，在TMZ与MET联合应用清除GSCs机制中，TMZ可能的作用尚未确定，而MET可能在其中起主导作用。越来越多的证据[5,14-15]表明：MET能选择性靶向并杀灭多种肿瘤干细胞，包括乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌和GSCs等。另外，MET能诱导GSCs分化，分化的GSCs丧失其起动肿瘤的性能[11,16-18]。MET能迅速通过血脑屏障并蓄积在脑实质，已在2型糖尿病治疗中应用多年，其安全性好，对非糖尿患者无降血糖作用。TMZ是目前治疗恶性胶质瘤的一线化疗药物。将TMZ与MET联合应用治疗胶质瘤，具有重要临床应用价值。当然，使用TMZ联合MET治疗胶质瘤还有许多问题有待解决，如MET的剂量、用药时机、给药疗程和疗效评价指标等，期待未来有更多实验给予验证。

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Elimination of temozolomide in combination with metformin on glioma stem cells and its mechanism

YU Zhiyun1,LI Yunqian1,CHEN Yong1,ZHAO Liyan2,LIU Huanbing1,WANG Nan1,WANG Bin1,CHEN Yunzhao1,ZHAO Gang1

(1.Department of Neurosurgery,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021, China；2. Department of Clinical Laboratory,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo explore the effect of temozolomide (TMZ) in combination with metformin (MET) on the elimination of glioblastoma stem cells(GSCs)invitro,and to clarify the mechanism. Methods The human glioma U87 cells were cultured in the neural stem cell medium,and the GSCs were identified by immunofluorescence methods；the GSCs were selected and were treated with control solution(control group), different concentrations of TMZ(TMZ group)and MET(MET group) or TMZ combined with MET(TMZ+MET group).The number of secondary neurospheres were counted under microscope, and the inhibitory rate of proliferation of GSCs was detected by CCK-8 assay;flow cytometry and Annexin Ⅴ and PI staining flow cytometry were used to detect the percentage of cell cycle and the apoptotic rate of GSCs，respectively. ResultsCompared with control group， the number of secondary neurospheres in TMZ+MET group was significantly decreased in a concentration-dependent manner;the number of secondary neurosphere in TMZ+MET group was significantly lower than those in TMZ group and MET group(P<0.01).Compared with control group, the inhibitory rates of the proliferation of GSCs in TMZ and MET groups were increased,the inhibitory rate of proliferation of GSCs in TMZ+MET group was higher than those in TMZ group and MET group(P<0.05),and the combination index(CI)<1.The flow cytometry results displayed that the percentage of the cells at G2/M phase in TMZ + MET group was significantly higher than those in TMZ group and MET group(P<0.05)，and the apoptotic rate of GSCs in TMZ+MET group was significantly higher than those in TMZ group and MET group (P<0.05).ConclusionThe combination of TMZ and MET can inhibit the serial self-renewal capability of GSCs as well as eliminate GSCs,and its mechanism may be related to the inhibition of the cell cycle progression of GSCs and induction of apoptosis.

temozolomide; metformin; glioblastoma stem cells; self-renewal

1671-587Ⅹ(2015)02-0321-06

10.13481/j.1671-587x.20150223

2014-12-31

吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(20140414060GH)

余志云(1987-)，男，湖北省宜昌市人，在读医学博士，主要从事胶质瘤基础与临床方面的研究。

李蕴潜，教授，主任医师，硕士研究生导师 (Tel：0431-88782331，E-mail：13943188080@163.com)；

赵刚，教授，主任医师，博士研究生导师(Tel：0431-88782331，E-mail：zhaogang@jdnwk.com)

R730.264

A