邻苯二甲酸二丁酯对成年大鼠睾丸Leydig细胞中Cx43蛋白表达及睾酮分泌的影响

靳曙光，张　燚，李泠仪，李　环

(北华大学公共卫生学院环境卫生学教研室,吉林 吉林 132013)

邻苯二甲酸二丁酯对成年大鼠睾丸Leydig细胞中Cx43蛋白表达及睾酮分泌的影响

靳曙光，张燚，李泠仪，李环

(北华大学公共卫生学院环境卫生学教研室,吉林 吉林 132013)

目的：观察邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对成年大鼠睾丸Leydig细胞中连接蛋白43(Cx43)的表达及睾酮分泌的影响，探讨DBP对睾酮的调节是否与Cx43有关联。方法：将SD大鼠无菌脱臼处死，原代培养纯化Leydig细胞，将细胞分为溶剂对照组(0.1%DMSO)、DBP组(50 mg·L-1DBP)、Cx43增强剂组(50 mg·L-1DBP+10 μmol·L-1PGE2)和特异睾酮阻断剂组(40 μmol·L-1氟他胺)，分别处理细胞24 h；放射免疫法测定Leydig细胞睾酮水平；细胞免疫荧光和Western blotting法检测细胞中Cx43蛋白表达。结果：细胞染毒24 h后，与DMSO组比较，DBP组Leydig细胞中Cx43蛋白表达水平和睾酮水平均降低(P<0.05)；与DBP组比较，DBP+PGE2组Leydig细胞中Cx43表达水平升高(P<0.05)，但睾酮水平变化不明显(P>0.05)；与DMSO组比较，氟他胺组Leydig细胞中睾酮水平和Cx43蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。结论：DBP对睾酮分泌及Cx43表达均有影响，Cx43对睾酮合成无抑制作用，而睾酮可反向调节Cx43表达；DBP对Leydig细胞睾酮合成抑制作用并不一定以Cx43为靶点。

邻苯二甲酸二丁酯；Leydig细胞；Cx43；睾酮

邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)是环境内分泌干扰物中重要的一类，被广泛应用到工业生产中。由于DBP并非以化学键的形式绑定在聚合基质中，因此在其使用过程中不断的向外界环境迁移，造成环境污染[1]。很多研究[2-3]表明：DBP具有显著的雄性生殖毒性，可引起雄性啮齿类动物睾丸萎缩和质量减轻，睾丸标志酶活性降低，精母细胞和精子细胞丧失、曲细精管变性萎缩及生殖道畸形等。但与其他抗雄性激素不同的是，DBP并不直接作用于雄激素受体，而是通过扰乱睾丸Leydig细胞中睾酮的生物合成而引起相应的生殖毒性，其具体作用机制尚不十分清楚[4-5]。缝隙连接胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)是相邻细胞间信息传递的一种通讯方式，在睾丸中广泛存在。研究[6]表明：其对睾丸发育进程的影响以及精子发生等有重要意义。Cx43是缝隙连接(gap junction ，GJ)在睾丸中最主要表达的蛋白，其在睾丸中的功能特别是精子形成和紧密连接调节的重要作用已有报道[7-8]，Cx43也是迄今为止在Leydig细胞中唯一表达的蛋白[9]，但是其在睾丸Leydig细胞中的作用尚不清楚。虽然DBP的生殖毒性已有大量报道，但尚未见其对睾丸Leydig细胞睾酮合成机制影响的研究。本实验以Cx43为检测靶点，采用Western blotting和免疫荧光法观察DBP对Leydig细胞中Cx43的表达及其分泌睾酮水平的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器清洁级成年雄性健康SD大鼠4只(吉林大学实验动物研究中心提供)，动物生产许可证号：SCXK(吉)2010-0005。DMEM/F12、胎牛血清购自美国Gbico公司；DBP、胶原酶Ⅰ、PGE2、氟他胺、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的羊抗小鼠ⅠgG抗体和睾酮测定试剂盒均购自美国Sigma公司；percoll细胞分离液购自美国Pharmacia公司；4,6-联咪-2-萘基-吲哚(DAPI)、小鼠抗大鼠Cx43多克隆抗体及兔抗大鼠β-actin多克隆抗体购自中国Solarbio公司。酶标仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶成像分析仪购自美国ABI公司；倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；倒置生物显微镜及数字照相设备购自日本Nikon公司。

1.2Leydig细胞分离和鉴定根据Genissel等[10]的方法并加以改进：取成年雄性SD大鼠，无菌取双侧睾丸，去血管和被膜，D-Hank’s液冲洗后加入0.5%胶原酶Ⅰ，34℃水浴振荡，加入含有10%胎牛血清终止。静止3 min取上清，经200目细胞筛过滤，D-Hank’s清洗， 1 000 r·mim-1离心5 min，漂洗2次，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，反复吹打制成细胞悬液2 mL。用移液管吸取各密度percoll细胞分离液2 mL，按密度由高到低贴壁缓慢叠加到10 mL离心管中(梯度自下而上分别是70%、58%、30%和5%)，将待分离的单细胞悬液添加到最高层。2 000 r·mim-1离心，离心后静止5 min，在30%和58%percoll浓度之间的条带即为目标细胞，将条带用吸管吸出，离心洗涤细胞2次，计数细胞，使细胞浓度稀释为10×105mL-1，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。利用3β-HSD染色法对细胞纯度进行鉴定。

1.3实验分组和给药将Leydig细胞分为实验组(50 mg·L-1DBP)、Cx43增强剂组(50 mg·L-1DBP+10 μmol·L-1PGE2)、特异睾酮阻断剂组(40 μmol·L-1氟他胺)和溶剂对照组(0.1% DMSO)。

1.4Leydig细胞睾酮值测定收集不同处理组24 h后的培养液，采用睾酮检测试剂盒以放射免疫法测定Leydig细胞中睾酮水平，具体操作流程按照试剂盒说明书进行。

1.5免疫荧光法检测各组细胞中Cx43蛋白的表达将各组Leydig细胞培养24 h后，弃去旧培养液，用无血清培养液培养 6 h，按照如下操作步骤：细胞经4%的多聚甲醛室温固定30 min，加入兔抗大鼠Cx43多克隆抗体(1∶100)4 ℃下过夜，加入TRITC标记的IgG后室温孵育1 h，并采用DAPI(100 μg·L-1)染核，室温下孵育5 min，最后以50%缓冲甘油封片，荧光显微镜观察Cx43在细胞中的表达情况。

1.6Western blotting法检测各组细胞中Cx43蛋白表达水平收集细胞，加入细胞裂解液后超声仪充分裂解，收集细胞蛋白样品，BCA法测定浓度，以每泳道50 μg蛋白上样制备好的样品，经SDS-PAGE电泳后，电转移至NC膜，加入Cx43(1∶100)一抗，4℃过夜，用TBST洗膜3次，每次10 min。加入山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室温下暗盒孵育1 h，底物显色，用红外激光扫描系统成像，采用Quantitiy One软件对目的条带灰度进行定量分析,Cx43蛋白表达水平=Cx43蛋白的灰度值/Tublin的灰度值。

2　结　果

2.1大鼠睾丸间质细胞形态学经3β-HSD法鉴定，镜下可见大鼠睾丸间质细胞呈蓝黑色，而其他睾丸细胞不着色;贴壁24 h后，弃培养液和未贴壁细胞，获得较高纯度的大鼠睾丸间质细胞，纯度达95%以上细胞融合度达75%～80%时，细胞数可达3×106～4.5×106个(图1，见插页四)。

2.2各组Leydig细胞睾酮水平染毒24 h后，与DMSO组比较，DBP组、DBP+ PGE2组和氟他胺组大鼠Leydig细胞睾酮水平显著降低(P<0.05)；但DBP组与DBP+ PGE2组大鼠Leydig细胞睾酮水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1各组大鼠Leydig细胞中睾酮水平

GroupTestosteronelevelDMSO16.92±1.85DBP+PGE210.16±1.31*Flutamide2.31±0.27*DBP8.73±1.08*

*P<0.05vsDMSO group.

2.3各组睾丸间质细胞中Cx43蛋白表达细胞免疫荧光结果显示：细胞染毒培养24 h后，DMSO组大鼠睾丸Leydig细胞中Cx43广泛表达，DBP组大鼠睾丸Leydig细胞中Cx43蛋白表达减弱。DBP+PGE2组加入Cx43增强剂PGE2后，Cx43恢复表达，接近DMSO组表达水平，氟他胺组大鼠睾丸Leydig细胞中Cx43表达明显减弱，见图2(插页四)。Western blotting结果显示：与DMSO组比较，DBP组Leydig细胞中Cx43蛋白表达水平降低(P<0.05)；DBP+PGE2组Leydig细胞中Cx43蛋白表达水平高于DBP组(P<0.05)；氟他胺组Leydig细胞中Cx43蛋白表达水平低于DMSO组(P<0.05)。见图3和表2。

Lane 1:DBP group;Lane 2:Flutamide group;Lane 3:DBP+PGE2 group;Lane 4:DMSO group.

图3各组大鼠Leydig细胞中Cx43蛋白表达电泳图

Fig.3Electrophoregram of expressions of Cx43 protein in Leydig cells of rats in various groups

表2各组大鼠Leydig细胞中Cx43蛋白表达水平

GroupCx43/TublinDMSO8.4805±0.7885DBP+PGE26.8606±0.5865△Flutamide4.9884±0.6553*DBP3.9997±0.4642*

*P<0.05vsDMSO group;△P<0.05vsDBP group.

3　讨　论

DBP作为公认的环境内分泌干扰物广泛存在于聚氯乙烯、建筑材料、食品包装固定液、洗衣粉、润滑剂和医疗设备等中，DBP具有显著的雄性生殖毒性，可以导致大鼠睾丸萎缩、精母细胞和精子细胞丧失、曲细精管变性萎缩及生殖道畸形等，而引起此变化与其抗雄性激素作用有关联[2-3]。研究[4-5]表明：DBP并不直接作用于雄激素受体，而是通过扰乱睾丸Leydig细胞中睾酮的生物合成而引起相应的生殖毒性，其具体作用机制尚不十分清楚。GJIC是通过由连接蛋白构成的GJ结构来实现的一种信息通讯方式，存在于相邻细胞间，在维持细胞间信息的传递、调节细胞增殖、分化和维持组织内环境的稳态等过程中均起十分重要的作用[11]。Cx43是GJ在睾丸中最主要表达的蛋白，Brehm等[13]利用基因敲除技术，特异性敲除大鼠支持细胞中的Cx43，结果在大鼠成年后，睾丸质量仅达到对照组大鼠的50%。免疫组织化学研究[12-13]结果显示：睾丸支持细胞持续增殖且出现分化障碍，近腔室内已无生殖细胞但基底室细胞正常，甚至出现唯支持细胞综合征。研究[14]显示：Cx43与紧密连接蛋白表达位置基本一致，且在生精上皮周期第Ⅷ期紧密连接更新过程中，Cx43表达发生显著改变。在Leydig细胞中Cx43是唯一表达的连接蛋白，研究[15]表明：Leydig细胞数量和体积增加的同时伴随着Cx43表达水平升高。本文作者推测DBP可以对Leydig细胞中Cx43产生影响，且DBP对睾酮的调节是以Cx43为靶点起作用。

本研究结果显示：Leydig细胞染毒24 h后，与DMSO组比较，DBP组、DBP+ PGE2组和氟他胺组大鼠Leydig细胞睾酮水平显著下降，证实了DBP可降低睾酮水平的结论，这与相关文献[14]报道一致；但DBP组和DBP+ PGE2组大鼠Leydig细胞睾酮水平无明显差异，这说明睾酮的生物合成过程与GJIC中Cx43变化无关联。

本研究中细胞免疫荧光检测Leydig细胞中Cx43蛋白的表达结果显示：Leydig细胞染毒24 h后，DMSO组细胞中Cx43广泛表达，而DBP组Cx43蛋白的表达出现明显抑制，当加入PGE2后Cx43表达水平恢复接近对照组，而加入氟他胺后Cx43表达明显下降。因此，外源化学物DBP对Cx43功能有明显抑制作用，同时睾酮水平的改变与Cx43蛋白表达水平有关联，且Western blotting结果也证实了这一变化规律，即DBP可显著抑制Cx43总蛋白表达；加入PGE2后Cx43蛋白表达水平显著提升，氟他胺组Cx43蛋白表达水平下降。

综上所述，DBP可引起睾丸Leydig细胞中睾酮分泌降低，同时抑制Cx43表达，但Cx43变化对睾酮合成无抑制作用，而睾酮值变化却反向调节Cx43表达。本文作者认为：DBP对Leydig细胞睾酮合成抑制作用并不一定以Cx43为靶点调节。

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Effects of dibutyl phthalate on expression of Cx43 protein and testosterone excretion in Leydig cells of testicle in adult rats

JIN Shuguang,ZHANG Yi,LI Lingyi,LI Huan

(Department of Environmental Hygiene,Institute of Public Health,Beihua University, Jilin 132013,China)

Objective To explore the effect of dibutyl phthalate(DBP) on the expression of Cx43 protein and testosterone excretion in the Leydig cells of testicle in the adult rats,and to disscuss whether there is relationship between the regulation of testosterone by DBP and Cx43.MethodsAfter the adult SD rats were killed, the cultured primary pure Leydig cells were divided into solvent control group(0.1%DMSO),DBP group (50 mg·L-1DBP),Cx43 enhancer group(50 mg·L-1DBP +10 μmol·L-1PGE2),and specific testosterone blocker group (40 mg·L-1flutamid).After cultured for 24 h，radioimmunoassay was used to measure the levels of testosterone in the Leyding cells; cell immunofluorescence and Western blotting method were performed to detect the expressions of Cx43 protein in the Leydig cells.ResultsCompared with DMSO group,the level of testosterone and the expression level of Cx43 protein in the Leydig cells in DBP group were decreased after 24 h exposure(P<0.05).Compared with DBP group,the testosterone level in DBP+PGE2 group had no obvious change(P>0.05),but the expression level of Cx43 protein was increased(P<0.05).Compared with DMSO group,the level of testosterone and the expression level of Cx43 protein in flutamide group were decreased significantly(P<0.05).ConclusionDBP has the effects on the Cx43 expression and testosterone excreation,and Cx43 has no inhibitory effect on the synthesis of testosterone.However,testosterone can regulate the expression of Cx43 reversely.Therefore,it’s not necessary to take Cx43 as the target of DBP in adjusting the synthesis of testosterone in Leydig cells.

dibutyl phthalate;Leydig cells;Cx43;testosterone

1671-587Ⅹ(2015)02-0295-04

10.13481/j.1671-587x.20150217

2014-09-16

吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(20100139，201205038)；吉林省教育厅科研项目资助课题(2011129，2014211);北华大学大学生国家级创新项目资助课题(201310201050)

靳曙光(1966-)，男，吉林省吉林市人，副教授，医学博士，主要从事环境卫生学方面的研究。

李环，讲师(Tel:0432-64608343,E-mail:jllihuan@126.com)

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