脂肪来源干细胞对兔扩张后皮肤质量的影响

吴彩风， 张泽敏， 姚永明， 阎 贺， 牛常英， 谭慎兴， 杨彪炳

脂肪来源干细胞对兔扩张后皮肤质量的影响

吴彩风， 张泽敏， 姚永明， 阎 贺， 牛常英， 谭慎兴， 杨彪炳

目的 探讨皮下局部注射脂肪来源干细胞(ADSCs)对扩张皮肤胶原纤维含量、微血管含量及皮肤厚度等的影响。方法 取新西兰大白兔的腹股沟脂肪，体外分离，培养获取，鉴定ADSCs；随机将20只新西兰大白兔分为实验组(n=10)与对照组(n=10)，每只兔背部皮下埋置1枚扩张器 (30ml)。实验组于局部皮下注射ADSCs悬液1ml；对照组注射无血清DMEM培养基1ml；完成扩张后，切取扩张皮肤组织，并对其进行HE染色，观察皮肤厚度及微血管密度；Masson三色染色，观察胶原纤维情况；采用Elisa检测皮肤组织中碱性成纤维生长因子(bFGF)的表达量。结果 实验组扩张后，皮肤厚度与对照组比较，差异有统计学意义 (P<0.05)；实验组微血管密度明显高于对照组(P<0.05)；Elisa检测结果示：实验组bFGF较对照组表达量增多 (P<0.05)；实验组胶原纤维较对照组数量多，且粗大。结论ADSCs能够促进碱性成纤维细胞生长因子表达，提高扩张皮肤中胶原纤维含量及微血管密度，增加扩张后皮肤厚度，提高扩张皮肤质量。

脂肪来源干细胞； 扩张皮肤； 碱性成纤维细胞生长因子； 胶原纤维； 微血管密度

皮肤软组织扩张技术,自1957年Dr. Neumann发明并首先应用后,临床应用日臻广泛。经过多年的发展，现已成为整形外科的常规治疗手段之一。但是，由于其扩张周期较长、扩张皮肤面积有限、扩张后皮肤质量差等缺点，限制了传统单纯扩张技术的应用[1]。近年来，不断有学者试图通过机械或药物等手段改善以上缺点，将脂肪组织中分离获取的多能干细胞，经过诱导，使其具有多项分化能力，并能够分泌多种细胞生长因子[2]。自2014年9月至2015年3月，本研究通过探讨皮下局部注射脂肪来源干细胞(ADSCs)对扩张后皮肤胶原纤维含量的影响，以期提高扩张后皮肤的质量。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器

选择3个月龄新西兰大白兔(潍坊医学院动物中心提供)；DMEM低糖培养基(HYCLONE公司，美国)；胎牛血清(HYCLONE公司，美国)； bFGF鼠抗兔单克隆抗体(R&D公司，美国)；羊抗鼠IgG二抗(R&D公司，美国)；Mosson三色染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；DMIRE2型全自动倒置相差显微镜(LEICA公司，德国)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；30 ml硅橡胶软组织皮肤扩张器(上海威宁整形制品有限公司)；ELISA试剂盒(R&D公司，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 ADSCs的分离、培养、传代及鉴定 无菌条件下，取兔腹股沟区新鲜脂肪，置于无菌盘中，PBS反复冲洗，剔除肉眼可见的小血管、纤维隔、包膜及其多余的组织，并剪成糊状，以胰酶消化2 min，200目筛网过滤，加入完全培养基终止消化。室温下1200 r/min，离心10 min，弃上清；用低糖DMEM培养液重悬，接种于培养瓶中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，观察细胞增殖及形态特征。用细胞免疫荧光染色法检测ADSCs表面特异性标记物CD34、CD44、CD29及CD106的表达。

1.2.2 扩张模型建立 将20只新西兰大白兔随机分为实验组(n=10)和对照组(n=10)。采用4%异戊巴比妥钠(1.5ml/kg)行耳缘静脉麻醉；术区备皮，常规消毒、铺巾；垂直于脊柱方向开口，在深筋膜浅层置入30ml扩张器，并注入25ml生理盐水充盈扩张器，缝合皮肤切口。术后即刻，肌注40万U青霉素预防感染，连续3d。完成扩张器埋置即时，实验组于扩张区域局部皮下多点注射ADSCs悬液1ml(5.0×106/ml)；对照组同法仅注射无血清DMEM培养基1.0ml。7d拆线，并开始注水，每3d注水1次，4周后完成扩张(图1)。

1.2.3 皮肤组织学观察 4周后取出扩张器，并切取扩张皮肤组织，将其部分皮肤组织放于4%多聚甲醛中固定，另一部分置于液氮中保存备用。常规行石蜡组织切片、HE染色、Masson三色染色，在显微镜下观察其组织学情况，并用显微测量尺测量皮肤组织全层厚度和真皮厚度。1.2.4bFGF的Elisa检测 取扩张后皮肤组织标本500mg，用超声波细胞粉碎机粉碎组织细胞，在4 ℃ 1 2000r/min，离心15min，取上清液。按照Elisa试剂盒说明书进行操作，检测bFGF的表达，终止反应后，酶标仪450nm波长处，读取吸光值，并计算浓度。

1.2.5 微血管密度检测 先在100倍镜下，随机找出10个微血管着色最高的区域，然后在200倍镜下计数着棕色的微血管数，取其均数即为微血管密度(MVD)[3]。

1.2.6 成纤维细胞密度检测 先在200倍镜下随机找出10个成纤维细胞核着色最高的区域，然后在400倍镜下计数着红色的细胞核数，取其均数即为成纤维细胞密度。

2 结果

2.1 ADSCs形态学观察及免疫细胞化学鉴定

原代ADSCs圆形、透亮，6～8 h开始贴壁生长，呈短梭形，24 h后细胞充分伸展；7 d左右，细胞呈鱼群样聚集，彼此融合，呈长梭形分布。免疫荧光细胞化学检测结果显示，ADSCs特异性标志物CD29、CD44呈阳性表达 (图2)。

2.2 Elisa检测结果

实验组bFGF平均表达量(149.40±13.69) pg/ml,明显高于对照组(103.28±11.47) pg/ml，P<0.05。见表1，图3。

2.3 扩张后皮肤组织形态结构变化

实验组皮肤全层厚度及真皮厚度均较对照组厚(图4)，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组毛细血管较对照组明显增多(图5)，MVD显著高于对照组，其两组间比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；实验组成纤维细胞密度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4Masson三色染色结果

胶原纤维呈蓝色。实验组胶原纤维增多、增粗，形态自然迂曲，无断裂，排列整齐致密且与皮面平行；对照组胶原纤维稀疏，拉伸严重，部分胶原纤维有断裂。见图6。

3 讨论

皮肤软组织扩张技术，主要是让皮肤在张力的作用下逐渐扩张，从而获得与皮损区域质地、色泽、厚度近似的皮肤[4-5]。但如何提高扩张皮肤质量，是目前研究的热点。随着组织工程研究的飞速进展，以及对干细胞研究的日渐深入，干细胞广泛应用于临床指日可待。由于ADSCs具有获取简单、来源丰富、无毒副作用，以及免疫原低等优势，同时能够避免许多伦理问题，目前正成为理想的种子细胞。国内外研究证实，ADSCs在体外环境中可以被VEGF、bFGF等诱导分化血管内皮细胞、表皮细胞等，然而在体外或体内环境下，ADSCs又可以分泌VEGF、bFGF等，促进新生血管的生成，其本身也可以分化成为成熟细胞，改变局部微环境，从而改善扩张过程中导致的微创伤环境[6-9]。

图1 兔皮肤组织扩张模型 图2 免疫荧光检测(×200) a.CD29表达阳性 b.CD44表达阳性 图3 Elisa检测bFGF表达量 图4 扩张皮肤组织(HE ×50) a.对照组 b.实验组 图5 扩张皮肤中微血管(HE ×200) a.对照组 b.实验组 图6 扩张皮肤中胶原纤维(Masson ×400) a.对照组 b.实验组Fig 1 Model of rabbit skin tissue expansion. Fig 2 Immunofluorescence (×200). a. positive expression of CD29 b. positive expression of CD44. Fig 3 Expression of bFGF by Elisa. Fig 4 Expanded skin tissue (HE ×50). a. the control group. b. the experimental group. Fig 5 The capillaries in the expanded skin (HE ×200). a. the control group. b.the experimental group. Fig 6 Collagen fibers of expanded skin (Masson ×400). a. the control group. b. the experimental group.

表1 Elisa检测两组bFGF表达量

注：*与对照组相比，P<0.05

表2 两组扩张后皮肤组织形态结构变化均值对比

组别皮肤全层厚度/mm真皮层厚度/mmMVD(个/视野)成纤维细胞密度(个/视野)实验组4.09±0.16*1.29±0.03*6.30±1.49*41.70±5.46*对照组2.73±0.170.68±0.043.10±1.2023.30±4.52

注：*与对照组相比，P<0.05

bFGF是促进细胞有丝分裂、分化的重要因子，其主要作用于成纤维细胞及内皮细胞等。在细胞周期中，使G0、G1期的细胞迅速进入S期，加快靶细胞的增殖和分化，使组织修复进程加快；bFGF还可以使成纤维细胞和内皮细胞突破细胞的外骨架，形成新的血管[10]。本研究显示：实验组bFGF表达量显著高于对照组，且实验组胶原纤维增多、增粗，胶原纤维束密集，形态自然迂曲，无断裂，排列整齐致密，且与皮面平行；而对照组胶原纤维稀疏，拉伸严重，部分胶原纤维有断裂。另外，实验组皮肤厚度显著大于对照组，且微血管密度高于对照组。可见注射ADSCs后，刺激了扩张皮肤胶原纤维的增多，从而促进微血管生成，保证了扩张皮肤的血供，增强其对缺血缺氧环境的耐受性，减少了皮肤组织在扩张情况下微创伤环境中所受到的损伤，提高了扩张皮肤质量。

综上所述，ADSCs能够促进bFGF的表达，提高扩张皮肤中胶原纤维含量及微血管密度，增加扩张后皮肤厚度，为提高扩张皮肤质量提供了一条新的道路，同时为今后的临床应用奠定了基础，值得进一步地研究和推广。

[1] 阎 贺, 张永平, 徐淑娟, 等. 脂肪来源干细胞对兔皮肤组织扩张后回缩率的影响[J]. 中国美容整形外科杂志, 2014,25(6):370-373.

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Effect of ADSCs on quality of rabbit skin after expansion

WUCai-feng,ZHANGZe-min,YAOYong-ming,etal.

(WeifangMedicalUniversity,Weifang261041,China)

Objective To investigate the effect of subcutaneous injection adipose-derived stem cells (ADSCs) on quality of rabbit skin after expansion. Methods Fat was harvested from groin of New Zealand rabbits, isolated and cultured in vitro, and then the ADSCs were identified; 20 New Zealand white rabbits were randomly divided into the experimental group (n=10)andthecontrolgroup(n=10),eachrabbitsubcutaneouswasburiedonegolddilator(30ml);eachintheexperimentalgroupwasinjected1mlADSCssuspensionintolocalsubcutaneous;whileeachinthecontrolgroupwasinjectedwithserum-freeDMEMmedium1ml.cuttheexpandedskintissuewascutandHEstainingwasusedtoobservetheskinthicknessandmicrovesseldensity;Massonthree-colorstainingwasappliedtodetectcollagenfiberscircumstances;Elisawasadoptedtodetectexpressionlevelsofbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)ofskintissue. Results Compared with the control group, the skin thickness in the experimental group had significantly statistical difference (P<0.05);MVDintheexperimentalgroupwassignificantlyhigherthanthatinthecontrolgroup(P<0.05);Elisatestresultsshowed:thebFGFintheexperimentalgroupwasmorethanthatinthecontrolgroup(P<0.05);thecollagenwasthesameasthebFGF. Conclusion ADSCs can promote the expression of basic fibroblast growth factor, increase the expansion of the skin collagen content and microvascular density, increase skin thickness after expansion and improve expanded skin quality.

ADSCs; Skin expansion; bFGF; Collagen Fiber; Microvessel density

山东省医药卫生科技发展计划项目(2014WS0470);潍坊医学院科技创新研究基金资助项目(K11TSl006) 作者单位：261041 山东 潍坊，潍坊医学院(国家组织工程中心山东分中心：吴彩风,张泽敏,姚永明,阎 贺,牛常英,谭慎兴；整形外科研究所：杨彪炳) 第一作者：吴彩风(1988-)，女，山东青岛人，硕士研究生. 通信作者：杨彪炳,261041,潍坊医学院 整形外科研究所,电子信箱：ybiaobing@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.09.021

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A

1673-7040(2015)09-0571-04

2015-07-23)

实验研究