广西百色市胎儿羊水地中海贫血基因检测分析

罗宏成，　王春芳，　向　阳，　雷　茗，　邓　鹰，　韦叶生（.暨南大学　附属第一医院　临床检验中心，广东　广州　50630；.右江民族医学院　附属医院　检验科，广西　百色　533000）

广西百色市胎儿羊水地中海贫血基因检测分析

罗宏成1，王春芳2，向阳2，雷茗2，邓鹰2，韦叶生2
（1.暨南大学附属第一医院临床检验中心，广东广州510630；2.右江民族医学院附属医院检验科，广西百色533000）

目的：运用分子杂交和基因芯片技术对百色市地中海贫血（简称“地贫”）孕妇进行羊水地贫基因检测，了解地贫胎儿的发病率及基因突变类型.方法：采用跨跃断裂点聚合酶链反应（gap-PCR）及膜－反向点杂交技术检测中国人常见的缺失型α-地中海贫血、突变型α-地中海贫血及β-地中海贫血.结果：检出单纯性α-地中海贫血145例（47.3%），中、重型α-地中海贫血52（36.2%），重型Barts水肿胎儿16例（11.3%），中型血红蛋白H病（HbH）病36例（24.8%）；单纯性 β-地中海贫血103例（33.6%），β-地中海贫血中重型28例（27.2%）；复合型 αβ地中海贫血21例（6.8%）；壮族人群α-地中海贫血发生率为56.6%，瑶族人群α-地中海贫血发生率为27.6%，汉族人群检出α-地中海贫血发生率为15.8%；壮族人群β-地中海贫血发生率为66.0%，瑶族人群β-地中海贫血发生率为21.4%，汉族人群β-地中海贫血发生率为12.6%.结论：百色地区胎儿羊水地贫基因检测阳性率较高，特别是中重型地中海贫血类型胎儿阳性率也很高；壮、瑶、汉各民族α-地中海贫血的发病率具有显著性差异（P＜0.05），壮、瑶、汉各民族β-地中海贫血的发病率无统计学差异（P＞0.05）.对该地区孕育胎儿的夫妇应该进行产前地中海贫血基因筛查及孕育知识的长期指导.

地中海贫血；羊水；基因型分析

地中海贫血（简称“地贫”）是世界上最常见的遗传性疾病，主要是由合成血红蛋白的珠蛋白肽链合成不足或缺少而引起的溶血性贫血.广西是中间型及重型地中海贫血患儿出生的高发区［1］.百色地区是广西经济发展比较落后的地区，高危地贫胎儿诊断达到29.6%［2］，给家庭和社会造成巨大的精神负担和经济压力.有效地开展胎儿羊水地中海贫血基因检测，了解孕育胎儿的地贫类型及基因型，对指导健康胎儿的出生及避免中重型高危地贫小孩的出生具有重大作用.

1　材料与方法

1.1标本

为2011年5月至2017年5月在右江民族医学院附属医院产前诊断中心行羊水穿刺地贫基因检测的来自百色市11个县的孕妇共307例，其中壮族197例；瑶族53例；汉族36例；仫佬族15例；苗族6例；彝族3例.主要由妇产科医生在B超指引下抽取16至21周期间胎儿羊水10 mL.避免羊水标本母体血液污染方法；在最佳羊水穿刺时间16～20周，由资深经验的妇产科医生在超声引导下，准确迅速进针达到穿刺深度，取出针芯，抽羊水者以小针筒抽取2 mL羊水丢弃以防母血污染，然后再换大针筒抽取羊水15～20 mL送检，采集两管各10 mL的羊水标本盛于无菌管中，其中一管直接离心收集细胞提取DNA进行检测，另一无菌管置于标准培养环境条件下进行羊水细胞培养后再提取DNA进行检测，根据培养前后基因型判断有无母血污染.用深圳亚能公司DNA快速提取试剂盒提取羊水里的细胞DNA.

1.2试剂及仪器

相关检测试剂均购自深圳亚能生物公司.仪器采用美国伯乐BIO-RAD S1000基因扩增仪PCR仪、美国伯乐BIO-RAD Gel Doc-xr凝胶成像仪、江苏兴化市-FYY-5型分子杂交仪、eppendorf低温高速离心机、珠海黑马H1干式恒温仪及2～1 000 μL eppen-dorf微量加样器.

1.3检测方法

（1）缺失型α-地中海贫血检测方法应用跨跃断裂点聚合酶链式反应（gap-PCR）的技术原理对3种常见缺失型αα/--SEA、αα/-α3.7、αα/-α4.2进行检测，再通过琼脂糖凝胶电泳来判断检测样品的基因型.PCR按以下条件进行扩增：96℃5 min；［98 ℃ 45 sec 65℃ 90 sec 72℃ 3 min］10 cycles；［98 ℃ 30 sec 65℃45 sec 72℃3 min］25 cycles；72℃10 min.

（2）突变型α-地中海贫血检测方法采用PCR和DNA反向点杂交（PCR-RDB）技术对中国人常见的三种突变QS、CS、WS进行检测.PCR按以下条件进行扩增：50℃15 min；95℃10 min；［94℃1 min，55℃30 sec，72℃30 sec］35 cycles；72℃5 min.

（3）β-地中海贫血的检测采用PCR和DNA反向点杂交（PCR-RDB）技术对中国人常见的突变位点CD17、CD41-42、-28，IVSI-1、βE进行检测.PCR按以下条件进行扩增：50℃15 min；95℃10 min；［94℃1 min，55℃30 sec，72℃30 sec］35 cycles；72℃5 min

1.4统计学分析

采用SPSS 13.0软件包进行统计学分析.基因型和基因型频率采用直接计算法，各民族间基因频率比较采用多个样本率比较的χ2检验，P＜0.05有统计学意义.

2　结果

2.1地中海贫血羊水检测结果

307例孕妇羊水地贫检测中共有269例羊水地贫基因阳性，阳性率达87.6%，其中单纯性α-地中海贫血145例（47.3%），单纯性β-地中海贫血103例（33.6%），αβ复合型地中海贫血21例（6.8%）.

2.2阳性α-地中海贫血基因型检测

阳性α-地中海贫血基因型检测详见表1.

表1　α-地中海贫血基因型检测结果Table 1　The results of Alpha thalassaemia genotype test

2.3αβ复合型地中海贫血基因型检测

αβ复合型地中海贫血基因型检测详见表2.

表2　αβ复合型地中海贫血基因型检测结果Table 2　The results of Alpha and Beta thalassaemia geno-type test

2.4阳性β-地中海贫血基因型检测

阳性β-地中海贫血基因型检测详见表3.

表3　β-地中海贫血基因型检测Table 3　The results of Beta thalassaemia genotype test

2.5壮、瑶、汉族三个民族α-地中海贫血的发生率及基因型

307例受检胎儿羊水中，仅统计占研究对象主体中壮、瑶、汉族三个民族人群发生率及基因型.其他民族人数及α-地中海贫血的例数少，未做统计.

壮族人群中检出α-地中海贫血82例，发生率为56.6%，基因型有11种.瑶族人群检出α-地中海贫血40例，发生率为27.6%，基因型有6种.汉族人群检出α-地中海贫血23例，发生率为15.8%，基因型有8种.经多样本率比较的X2检验，壮、瑶、汉各民族α-地中海贫血的发病率具有显著性差异（X2＝22.009，P＝0.000＜0.05），瑶族α-地中海贫血高于壮族和汉族.壮、瑶、汉各民族α-地中海贫血基因突变类型，见表4.

2.6壮、瑶、汉族三个民族β-地中海贫血的发生率及基因型

表4　壮、瑶、汉族各种α-地中海贫血基因型检测结果1）Table 4　The result of genotype of Alpha thalassaemia in Zhuang、Yao and Han populations

307例受检胎儿羊水中，仅统计占研究对象主体中壮、瑶、汉族三个民族人群发生率及基因型.其他民族人数及β-地中海贫血的例数少，未做统计.

壮族人群中检出β-地中海贫血68例，发生率为66.0%，基因型有17种.瑶族人群中检出β-地中海贫血22例，发生率为21.4%，基因型有10种.汉族人群中β-地中海贫血13例，发生率为12.6%，基因型有7种.经多样本率比较的2检验，壮、瑶、汉各民族β-地中海贫血的发病率无显著性差异（2＝0.886，P＝0.642＞0.05）.壮、瑶、汉各民族α-地中海贫血基因突变类型见表5.

表5　壮、瑶、汉族胎儿羊水各种　β-地中海贫血基因型检测结果1）Table 5　The result of genotype of Beta thalassaemia in Zhuang、Yao and Han populations

3　讨论

地中海贫血又称海洋性贫血，因最早在地中海、意大利、希腊等地区发现，故称地中海贫血.据2008年世界血红蛋白病流行病学报告，每年大约有56 000例重型β-地中海贫血，其中至少有30 000例需规范输血才能存活，5 500例重型α-地中海贫血死于围生期［3－4］.我国南方地区各地报道的地贫基因缺陷率为2.5%～20%，广东及广西两省地贫基因缺陷发生率分别高达10%及20%，两省地贫的病例数占全国总数的2/5以上［5］.目前，世界上对地贫的筛查与诊断主要运用基因诊断，地贫的治疗目前尚无特效疗法，诊断和预防重型地贫胎儿的发生极其重要.百色地区是广西地中海贫血的高发区，因此，本研究首次对各民族胎儿羊水基因型及基因频率在百色地区的分布情况进行统计分析，对地贫的筛查和孕育指导具有重大的意义，可以有效控制本地区高危人群中、重型地贫患儿的出生，从而可降低出生缺陷.

地中海贫血主要分为α-地中海贫血和β-地中海贫血两种主要类型.α-地中海贫血主要由于合成α珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成，中国南方常见缺失型 α-地中海贫血有 αα/--SEA、αα/-α3.7、αα/-α4.2，常见突变型α-地中海贫血有αα/ααQS、αα/ααCS、αα/ααWS等［6］.β-地中海贫血主要由合成β珠蛋白的基因所突变造成的，中国南方常见的β-地中海贫血主要有CD17、CD41-42M、IVSI-1、-28M、βE等［7］位点突变.地中海贫血按临床病情主要分为轻型、中间型、重型，轻型地中海贫血出生后多无症状，中间型地中海贫血靠输血可以活到成年，重型地中海贫血多数胎死腹中或出生后即死亡.地中海贫血是一种常见单基因遗传病［8］，其基本特征是遗传物质发生改变，疾病从父母传至子女，其发病几乎完全由遗传因素决定.地中海贫血是常染色体隐性遗传病［9］，只有在纯合子时才发病，故基因携带者通常无生理异常，大部分地中海贫血基因携带者并不知道自己是携带者，常规检查很难确定基因携带者，若夫妻双方同为地贫基因携带者，则重型地中海贫血患儿出生的概率为25%［10］，地中海贫血也是一种严重的血液性疾病［11］，目前尚无特效治疗.因此，有效地开展地中海贫血基因的检测，特别对于地贫高发区的婚育年龄的地贫基因携带夫妇进行大规模的筛查是必要的预防措施，是降低地贫患儿出生率的有效措施，开展胎儿羊水地贫基因检测是避免重型地贫小孩出生的最好方法.本研究结果所得百色地区α-地中海贫血发生率（47.3%），β-地中海贫血发生率（33.6%），复合型αβ地中海贫血发生率（6.8%），与陈秋莉等［12］研究相近，所检测出的中型地中海贫血血红蛋白H病（HBH）（24.8%），比同为地贫高发区的广东惠州高，重型地中海贫血Barts（11.3%）胎儿水肿，比何丽等［13］报道惠州地区相一致.所检测出的β-地中海贫血中重型（27.2%）比例相对高，重型β-地中海贫血比何丽等［14］报道相对低，是因为本次研究对象为地中海贫血夫妻双方为地贫基因携带者或其中一方为携带者都纳入本次实验中.

综上所述，本次研究对百色地区胎儿羊水地贫基因的发病率及突变类型有一定的了解，为本地区产前诊断的筛查提供了一些基本的方向.本实验没能分析夫妻双方的基因型及其的遗传规律，这项研究有待具体的遗传信息学系统分析，也是今后本课题的努力研究方向.

［1］蒙达华，杜娟，张海燕.B超引导下妊娠中期行羊膜腔穿刺4611例产前诊断安研究［J］.中国优生与遗传杂志：，2011，19（5）：52－53.

［2］冯燕妮，潘红飞，黄月艳.百色市人口计生和卫生系统共同实施地中海贫血综合防控试点效果分析［J］.中国妇幼保健，2014，29（8）：1159－1162.

［3］Thalassemia International Federation.Guidelines for the clinical management of thalassemia［M］.2nd ed.Nicosia：Thalassaemia Internation Federation，2008：21－27.

［4］BERNADETTE M，MATHEW D.Global epidemiology of haemoglobin disorders and derive service indicators［S］.Public health reviews.Bulletin of the World Health Or-ganization，2008，86（6）：480－487.

［5］李长钢.地中海贫血临床诊治中存在的问题［J］.临床儿科杂志，2009，27（8）：714－717.

［6］段山，李洪义，陈争.中国南方α地中海贫血基因突变型研究［J］.中国实验血液学杂志，2003，11 （1）：54－60.

［7］石西南，褚嘉祐，杨昭庆.中国不同省区β地中海贫血基因变异的分布特征［J］.医学综述，2011，17（4）：495－497.

［8］Ho-Wan Ip，Chi-Chiu So.Diagnosis and prevention of thalassemia［J］.Crit Rev Clin Lab Sci，2013，50（6）：125－141.

［9］GALANELLO R.Recent advances in the molecular un-derstandingofnon-transfusion-dependentthalassemia ［J］.Blood Rev，2012，26（Suppl 1）：7－11.

［10］徐湘民，地中海贫血预防控制操作指南［M］.北京：人民军医出版社，2011：2－5.

［11］BUCCI E，LO MUZIO L，MIGNOGNA M D.Beta-thalassemia and its orodental implications.I.The clinical considerations［J］.Minerva Stomatol，1990，39（1）：1 －8.

［12］陈秋莉，张强，唐燕青.2226例地贫羊水产前诊断分析［J］.中国优生与遗传杂志，2014，22（12）：70－71.

［13］朱晓洁，刘宇鹏，刘瑞玉.惠州市同型α地中海贫血夫妇的胎儿产前地贫基因诊断分析［J］.中国儿童保健杂志，2015，23（1）：15－17.

［14］朱晓洁，刘宇鹏，刘瑞玉.惠州市同型β地中海贫血夫妇的胎儿产前地贫基因诊断分析［J］.中国儿童保健杂志，2015，23（8）：1.

［责任编辑：陈咏梅］

Detection and analysis of thalassemia gene of the fetal amniotic fluid in baise city

LUO Hongcheng1，WANG Chunfang2，XIANG Yang2，LEI Ming2，DENG Ying2，WEI Yesheng2
（1.Department of Laboratory Center，the First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510630，China；2.Department of Laboratory Center，Affilated Hospital of You Jiang Medical College for Nationalities，Baise，533000，China）

Aim：Using the molecular hybridization and gene chip technology to detect the thalassemia gene of pregnant women with thalassemia in Baise city，to learn the incidence and mutation types of the Fetal with thalassemia.Methods：Using the gap Polymerase Chain Reaction（gap-PCR）and membrane-reverse dot hybridization technique to detect the lack of Chinese common type of alpha thalassaemia，the mutant of alpha thalassaemia and beta thalassaemia.Results：One hundred and forty-five cases were di-agnosed with simple alpha thalassaemia which accout For 47.3%，the Medium and heavy of alpha thalas-saemia accout for 36.2%，and 16 case of Hb Barts hydrops fetalis tire having heavy alpha thalassaemia accout for 11.3%，36 cases were diagnosed with HbH disease which accout for 24.8%；145 cases were diagnosed with simple Beta thalassaemia which accout for 33.6%，and the Medium and heavy of Beta thalassaemia accout for 27.2%；21 cases were diagnosed with the Compound of alpha and beta thalassae-miawhich accout for 6.8%；The incidence of alpha thalassaemia in Zhuang populations was 56.6%，27.6%in Yao populations，and 15.8%in Han populations；The incidence of Beta thalassaemia in Zhuang populations was 66.0%，21.4%in Yao populations，and 12.6%in Han populations.Conclu-sion：The positivty of fetal amniotic fluid with thalassemia is higher in Baise city.Especially，the positive rate of Medium and heavy of fetal is also high；The incidence of alpha thalassaemia was significant differ-ence in Zhuang，Yao，Han Populations（P＜0.05），The incidence of beta thalassaemia was no statistical difference in Zhuang，Yao，Han Populations（P＞0.05）.Couples who will give birth to baby in the re-gion should make prenatal genetic of thalassemia screening and breeding knowledge guide.

thalassemia；amniotic fluid；genotype analysis

R715.5

A

1000－9965（2015）06－0520－05

10.11778/j.jdxb.2015.06.014

2015－08－11

广西百色市科学研究与技术开发计划项目［百科计字（201204）1号］

罗宏成（1985－），男，检验师，研究方向：地中海贫血分子生物学

韦叶生，教授，Tel：0776－2853093，E-mail：wysh22＠163.com