抗肿瘤溶栓双功能嵌合蛋白截短突变体

黄秋妮　鹿腾　谢良秋

摘 要：临床研究显示，肾细胞肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、肝脏肿瘤等肿瘤患者经常会出现静脉血栓、弥散性血管内凝血、肺栓塞、游走性浅表血栓性静脉炎、门静脉血栓和动脉血栓栓塞等血栓栓塞性疾病。肿瘤发生与血栓形成的关系极为密切，血栓的形成在肿瘤转移、肿瘤血管生成机制中起着重要作用，而血栓又会加大癌症的发病率和死亡率。

关键词：恶性肿瘤；葡萄球菌激酶

金葡球菌肠毒素C2（staphylococcal enterotoxins，SEC2）是由金黄色葡萄球菌产生的一类超抗原，极低浓度下即可刺激大部分的T细胞增殖，使之释放多种细胞因子，产生强烈的免疫应答反应和显著的肿瘤抑制作用，临床上应用与肺癌、直肠癌、肝癌、卵巢癌等恶性肿瘤的治疗。葡激酶（staphylokinase ，Sak）是典型的第三代溶栓药物代表，与传统溶栓药物相比，葡激酶具有纤维酶原激活能力强的特点，并且免疫原性低，特异性高、过敏反应少，是目前相对较可靠和安全的心血管疾病治疗呢药物。

基于SEC2的广谱抗肿瘤活性和Sak的高效溶栓作用，构建嵌合蛋白SEC2-linker-Sak和Sak-linker-SEC2。实验中对SEC2和Sak都进行了必要的处理，可以说进行嵌合的SEC2是一种截短突变体，降低毒性和分子量，Sak也是一种不改变功能的突变体，进行此操作方便于构建嵌合体更好的在临床其作用。

1 恶性肿瘤并发血栓

恶性肿瘤并发血栓机制是恶性肿瘤相关的炎症可以导致凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原等急性期蛋白浓度增加，从而增加血栓形成的风险。血栓是恶性肿瘤的征兆，研究发现大多癌症患者的凝血系統都被激活了，而凝血酶能够促进肿瘤细胞生长，转移和侵袭，并且还能促使肿瘤血管新生。

2 恶性肿瘤并发血栓的治疗

肿瘤患者并发血栓或者疑似血栓时，无需确诊应立即进行抗凝治疗。目前临床上的抗凝药物多用低分子量肝素（LMWH）治疗10-14天，然后采用口服华法林治疗。由于口服华法林的效果较慢，并且在给药初期常常出现高凝状态，所以必须与肝素同时给药5-7天直到达到预期抗凝水平。肿瘤并发血栓的患者接受LMWH治疗后仍有高达9%的患者会出现血栓复发，肝素易引起血小板减少，因而不能持续给药。20%的接受华法林治疗患者会复发血栓，但一般不推荐增加华法林用药强度，因为增加华法林用药会增加出血的风险，并且不能减少血栓复发。

3 金黄色葡萄球菌肠毒素C2

3.1金黄色葡萄球菌肠毒素C2 （Staphylococcal enterotoxin C2， SEC2）

作为超抗原目前已普遍应用于抗肿瘤治疗，在中国临床应用最早的为沈阳协和生物制药公司开发的高聚生，其有效成分为金黄色葡萄球菌肠毒素C2。根据临床疗效观察，其确实起到了提高机体免疫力，减轻放化疗引起呕吐等肠道副反应，升高白细胞数量，消除恶性腹水，预防肿瘤复发和转移的作用，并且疗效显著，未见严重副作用，尤其与放疗或化疗联用效果更好。

SEC2对肿瘤细胞的杀伤作用主要体现在以下几个方面：

1） SEC2可以活化T细胞，直接杀伤表达MHC-11的肿瘤细胞，并且对不表达MHC-11的肿瘤细胞也可以产生一定的作用

2）被SEC2活化的T细胞可以分泌产生大量具有生物活性的细胞因子，包括IL-1， H--2， TNF-a ， IFN-仔口TNF-p等，这些细胞因子可以进一步活化l`}K细胞或者促进肿瘤细胞表达MHC-11，从而产生直接和间接的肿瘤细胞杀伤和抑制。

3.2 SEC2突变体

大量的实验结果显示，SEC2作为一种外源性超抗原，可以强烈地抗肿瘤，显然为肿瘤治疗提供了新想法。但是，SEC2真正用于临床抗肿瘤还存在着许多问题。首先，SEC2作为潜在的胃肠毒素，可引发呕吐，腹绞痛、严重腹泻等毒负反应。其次，作为潜在的抗肿瘤药物，SEC2是一种外源蛋白，分子量较大（由239个氨基酸残基组成，分子量大约27.6 kDa），不易于静脉注射和人体吸收，并能引起过敏反应。基于以上两点，SEC2的临床应用受到了很大限制。根据SEC2的晶体结构分析功能分析，确认从N端Gly 19起为SEC2的TCR结合位点，为保留其超抗原性，利用分子生物学技术，分别截去了SEC2 N端17个氨基酸残基与C端132个氨基酸残基，获得了去除毒副作用，保留超抗原性的超抗原小分子肽，并且其分子量大大降低。

4 金黄色葡萄球菌激酶

4.1 Sak及溶栓作用机制

葡激酶（staphylokinase， Sak）系由具有溶原性的金黄色葡萄球菌分泌的一种胞外蛋白，具有溶栓的特性。分泌成熟的Sak为136个氨基酸残基的单链多肽，分子量约为15 kD，分子内没有半肤氨酸，不含有二硫键。Sak本身并不是一种酶，不能直接使纤溶酶原转变为纤溶酶，它的活性是指其对纤溶酶原的激活效力而言的。Sak激活纤溶酶原的机制与链激酶相似，通过激活纤溶酶原（Plg）转变成纤溶酶（Plm），从而起到溶解血栓的作用，是典型的第三代溶栓药物。

4.2 Sak缺失突变体

研究报道葡激酶蛋白N端十几个氨基酸对纤溶酶原的激活无作用，利用现代分子生物学技术，得到N端缺失10个氨基酸的葡激酶缺失突变体，获得溶栓活性不变的葡激酶蛋白

5 突变体嵌合以及活性测试

从pET28a-sec2中PCR获得sec2基因片段，并将sec2插入载体

pET28a-sak，构建载体pET28a-sec2-linker-sak，将得到的载体pET28a-sec2-linker-sak经PCR去除sec2和sak之间的linker，平末端连接后转化大肠杆菌BL21 （ DE3 ）。转化子经酶切和测序确认得到表达载体pET28a-sec2 -Sak。将重组大肠杆菌接种于含40 [g/ml卡那霉素LB培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在30℃条件下用1mM IPTG诱导4-5小时，之后离心收集菌体细胞。用超声波破碎菌体细胞，10000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液，将上清液过Ni-NTA亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白His-SEC2-Sak。嵌合蛋白His-SEC2-Sak经过肠激酶切割，再次过Ni-NTA亲和层析柱，得到嵌合蛋白SEC2-Sak。同样的方法制备嵌合蛋白Sak -SEC2 。经实验验证所构建的突变蛋白嵌合体具有体外抗肿瘤的作用，且具有体外溶血栓的功能。

参考文献

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