EDTA-K2、枸橼酸钠抗凝剂依赖性假性血小板减少2例分析

白志瑶　孙继芹　尹春琼　王星花　包锐

EDTA-K2、枸橼酸钠抗凝剂依赖性假性血小板减少2例分析

白志瑶孙继芹尹春琼王星花包锐

作者单位:655000曲靖市，云南省曲靖市第二人民医院检验科

目的探讨2例EDTA（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-K2、枸橼酸钠抗凝剂依赖性假性血小板（platelet，PLT）减少患者PLT计数的检测方法。方法采用SYSMEX-4000i血细胞分析仪检测EDTA-K2和枸橼酸钠（1∶9）抗凝的PLT计数，采用手工稀释计数法作为参考方法。分别于采血后1 min、10 min、20 min、30 min、40 min、60 min和120 min检测PLT计数，并对两种抗凝剂血标本进行涂片瑞氏染色，在显微镜下观察PLT聚集情况。结果EDTA-K2抗凝的PLT在10 min时开始出现聚集现象，枸橼酸钠（1∶9）抗凝的PLT在20 min出现聚集现象，两种抗凝剂的PLT均在120 min达到聚集高峰。而EDTA-K2抗凝的PLT在各时间段的聚集情况均较枸橼酸钠（1∶9）抗凝的PLT明显。PLT计数结果显示，随着时间的延长，两种抗凝剂抗凝的PLT计数结果均呈下降趋势，其中EDTA-K2抗凝的PLT计数仅在1 min时在正常范围，枸橼酸钠（1∶9）抗凝的PLT计数在1 min和10 min时均在正常范围。枸橼酸钠（1∶9）抗凝的PLT计数在各时间段均高于EDTA-K2抗凝的PLT计数，但仍低于手工稀释计数法。结论PLT计数应尽量缩短检测时间，以避免时间对检测结果的影响，并注意EDTA-K2依赖性假性PLT减少的检出。对于EDTA-K2、枸橼酸钠两种抗凝剂均存在依赖性假性PLT减少的血标本，应采用手工稀释计数法进行检测，以避免因PLT假性减少引起的误诊、误治，为临床提供准确、可靠的治疗依据。

EDTA-K2；枸橼酸钠；假性血小板减少；血小板计数

乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）盐具有对红细胞、白细胞形态影响很小且能阻止血液凝固的优点，因此国际血液学标准化委员会于1993年推荐将EDTA-K2作为血细胞计数的抗凝剂，目前在世界各地得到广泛应用［1］。但在实际工作中，EDTA-K2抗凝剂可引起极少数人的血小板（platelet，PLT）发生聚集，导致血细胞分析仪PLT计数假性减少和白细胞假性升高的现象，即为EDTA依赖性假性血小板减少症 （EDTA-pseudo thrombocytopenic purpura，EDTA-PTCP），国外临床发生率为0.07%～1.0%，而国内报道为0.77%，国外有报道EDTA-PTCP用枸橼酸钠抗凝后，有72%的病例还是有聚集，但国内对此报道甚少［2］。我院自2014年1月-2015年9月共发现因EDTA-K2造成血小板假性减少患者7例，其中5例更换抗凝剂为枸橼酸钠（1∶9）后PLT计数正常，血涂片瑞氏染色显微镜检查显示PLT分布正常；2例EDTA-K2、枸橼酸钠（1∶9）两种抗凝剂均导致依赖性假性血小板减少，血细胞分析仪PLT计数结果异常，现报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料病例1，女性，32岁，因“反复性下腹疼痛1年半”于2015年2月1日入住我院妇科。入院初诊:1.慢性盆腔炎；2.右侧输卵管黏连并积水；3.鞍形子宫；4.查体:体温: 36.5℃、脉搏:68次/min、呼吸:18次/min、血压:102/69 mmHg，皮肤、巩膜无黄染、无瘀点、瘀斑；5.实验室检查:肝肾功能、电解质正常，传染病免疫标志物检测:阴性；凝血酶原时间:10.3 s、国际标准化比值:0.90、活化部分凝血酶原时间: 36.3 s、凝血酶时间:19.7 s、纤维蛋白原:2.01 g/L。2015年2月2日SYSMEX-4000i血细胞分析仪术前血常规结果:白细胞计数:8.02×109/L、红细胞计数:4.35×1012/L、血红蛋白:133 g/L、血细胞比容:37.1%、PLT:4×109/L、平均红细胞容积:85.3 fl、平均红细胞血红蛋白含量:30.6 pg、平均红细胞血红蛋白浓度:358 g/L、红细胞分布宽度 （red blood cell distribution width，RDW）-SD:33.1 fl、RDW-CV:11.0%。该患者于2015年2月4日行“腹腔镜盆腔黏连分离术+宫腔镜检查+美兰通液术”，手术顺利，术中出血约10 ml，属Ⅱ类切口，术后给予促宫缩、抗炎、对症治疗，病情恢复平稳，于2015年2月10日出院。遵医嘱，分别于3个月、6个月回访无特殊不适。

病例2，男性，86岁，因“咳嗽、咳痰、喘息、发热 1 d”，于2015年7月25日入住我院呼吸内科。入院初诊:1.查体:体温:38.5℃、脉搏:90次/min、呼吸:18次/min、血压:112/66 mmHg，一般情况欠佳，神清，唇舌发绀、咽部充血，肺气肿征象，双肺呼吸音低、双肺可闻及湿性啰音、散在哮鸣音，心律齐、未闻及杂音，腹软、剑突下压痛、无反跳痛，双下肢轻度水肿，皮肤、巩膜无黄染、无瘀点、瘀斑。2.实验室检查:总蛋白: 76.5 g/L、白蛋白:26.9 g/L、球蛋白:49.6 g/L、白蛋白/球蛋白:0.54、天门冬氨酸氨基转移酶:103 U/L、丙氨酸氨基转移酶:25 U/L、谷氨酰转移酶:46 U/L、胆碱酯酶:2025 U/L、低密度脂蛋白:249 U/L、高密度脂蛋白:263 U/L、葡萄糖:7.08 mmol/L；传染病免疫标志物检测:阴性；凝血酶原时间:14.7 s、国际标准化比值:1.08、活化部分凝血酶原时间:41.9 s、凝血酶时间:20.3 s、纤维蛋白原:2.12 g/L。2015年7月27日SYSMEX-4000i血细胞分析仪血常规结果:白细胞计数: 4.59×109/L、红细胞计数:3.66×1012/L、血红蛋白:109 g/L、血细胞比容:35.8%、PLT:11×109/L、平均红细胞容积:97.8 fl、平均红细胞血红蛋白含量:29.8 pg、平均红细胞血红蛋白浓度: 304 g/L、RDW-SD:60.8 fl、RDW-CV:18.1%。

1.2方法

1.2.1血细胞分析仪检测血常规标本分别采用EDTA-K2和枸橼酸钠（1∶9）抗凝，PLT计数采用SYSMEX-4000i血细胞分析仪检测。

1.2.2手工稀释法采用草酸盐溶液稀释血常规标本，血涂片经瑞氏染色后在显微镜下计数PLT。以手工稀释法为参考方法［3］评价血细胞分析仪对两种抗凝剂抗凝的血标本PLT计数情况。

1.2.3PLT各时间段聚集情况观察分别将EDTA-K2和枸橼酸钠（1∶9）抗凝的血标本在采集后1 min、10 min、20 min、30 min、40 min、60 min、120 min时进行涂片，经瑞氏染色后显微镜下观察PLT聚集情况。

2　结果

2.1EDTA-K2、枸橼酸钠（1∶9）抗凝的PLT聚集情况2例患者的EDTA-K2抗凝血标本在肉眼观察下无凝块，仪器检测时报警PLT聚集，PLT直方图出现翘尾、无拟合曲线，用抗凝血涂片瑞氏染色显微镜检查，可见PLT聚集，聚集的血小板数量不等、多少不一，呈小簇、成堆或片状分布，因而怀疑是EDTA-PTCP，当日即告知临床请患者到我科再次采集血标本，并分别采用EDTA-K2、枸橼酸钠（1∶9）2种抗凝剂抗凝，分别于1 min、10 min、20 min、30 min、40 min、60 min、120 min进行PLT计数，并用抗凝血涂片瑞氏染色在显微镜下观察，PLT在不同时间段呈不同程度聚集，在120 min时达到聚集高峰，可见小簇、成堆、片状聚集，见图1、图2（2例患者两种抗凝剂抗凝的血涂片各时间段PLT聚集情况相似）。

2.2血细胞分析仪检测两种抗凝剂PLT计数及手工稀释法PLT计数结果2例患者的手工PLT计数结果在各时间段变化不大，且均在正常范围。而分别采用EDTA-K2和枸橼酸钠（1∶9）抗凝的PLT计数结果随着时间的延长均呈下降趋势，其中枸橼酸钠（1∶9）抗凝的PLT计数结果在1 min和10 min时在正常范围，EDTA-K2抗凝的PLT计数结果仅于1 min时在正常范围。虽然枸橼酸钠（1∶9）抗凝的PLT计数结果在各时间段均高于EDTA-K2抗凝的PLT计数结果，但仍低于手工计数，见图3、图4。

图1　患者EDTA-K2抗凝血涂片各时间段PLT聚集情况（瑞氏染色，×1000）

3　讨论

PLT是由骨髓中成熟巨核细胞的胞质脱落而成，PLT的生理功能包括黏附、聚集、释放等，主要功能是凝血、止血作用和修补破损的血管，这些功能是在PLT激活后几乎同时出现的。当PLT计数降低时，很容易发生出血不止的现象，给患者的生命带来威胁。然而，临床有少数患者存在EDTAPTCP，导致检验结果不准确，无法指导临床治疗。

图2　患者枸橼酸钠（1∶9）抗凝血涂片各时间段PLT聚集情况（瑞氏染色，×1000）

EDTA-PTCP产生的原因与PLT表面存在的某种隐匿性抗原有关［4］。EDTA可诱导PLT活化，导致PLT糖膜改变［5］，即PLT形态发生变化，由正常的圆盘状变为圆球形，导致PLT膜表面某种隐匿性抗原构象的改变，这些活化的PLT与血浆中存在的自身抗体抗PLT抗体和（或）抗心磷脂抗体结合，激活细胞膜中的某些活性物质，这些活性物质能活化PLT纤维蛋白受体，促使PLT与FIB聚集成团［6］。血细胞分析仪错将聚集的PLT误认为WBC或巨大PLT从而导致PLT计数假性降低。而PLT计数假性降低若未及时发现，易导致临床发生误诊误治。而临床医生为了明确诊断，往往会进行骨髓穿刺涂片检查，个别病例甚至已经开始药物治疗，这样既增加了患者的痛苦和精神负担，同时也增加了医疗费用。

图3　病例1患者EDTA-K2、枸橼酸钠、手工PLT计数结果

图4　病例2患者EDTA-K2、枸橼酸钠、手工PLT计数结果

检验科在遇到PLT计数假性降低时，会选择更换抗凝剂［一般选择枸橼酸钠（1∶9）］后重新采血检测，以避免EDTAPTCP。枸橼酸钠是一种钙的螯合剂，呈碱性，可与钙离子形成可溶性螯合物，其抗凝性弱，易使PLT聚集而致其计数假性减少，并且枸橼酸盐抗凝能力不强，不仅对PLT计数有影响，对WBC计数和分类均有不同程度影响［7］。大部分EDTA-K2引起的假性PLT减少可以被枸橼酸钠纠正，但也有极少部分无法纠正［8］。

本文研究的2例患者，在采血后1 min、10 min、20 min、30 min、40 min、60 min和120 min时分别采用血细胞分析仪检测两种抗凝剂抗凝的PLT计数及手工稀释法PLT计数，并将抗凝血瑞氏染色涂片在镜下观察PLT聚集情况，结果显示，EDTA-K2抗凝的PLT在各时段均有不同程度的聚集，且在120 min达到聚集高峰，可见片状聚集。而枸橼酸钠（1∶9）抗凝的PLT在1 min时尚未出现聚集现象，在10 min时出现少量聚集，在120 min时达到聚集高峰，但其各时间段的聚集程度均没有EDTA-K2抗凝的PLT聚集明显，这与邝妙欢等［9］的报道一致。2例患者的血标本对EDTA-K2和枸橼酸钠（1∶9）抗凝剂均存在PLT计数假性减少，而且随着时间的延长PLT计数值也随之下降，枸橼酸钠（1∶9）抗凝的PLT计数结果在各时间段均高于EDTA-K2抗凝的PLT计数，但仍低于手工稀释法PLT计数。其中EDTA-K2抗凝的PLT计数仅在1 min时在正常范围，而枸橼酸钠 （1∶9）抗凝的PLT计数在1 min和10 min时均在正常范围，说明EDTA-K2较枸橼酸钠（1∶9）更易造成PLT假性减少，而且时间是导致抗凝剂依赖性假性PLT减少的原因之一。因此若进行血常规检测时出现PLT显著减少、直方图异常、仪器报警PLT聚集等，且患者无瘀点、瘀斑等出血情况，应高度怀疑EDTA-PTCP。采用血涂片镜检观察PLT的数量、形态，尤其要注意片尾、边缘是否有PLT聚集。同时请患者到检验科进行采血，以缩短标本检测时间，并更换抗凝剂重新检测，若仍无法纠正结果，应采用手工稀释计数法进行PLT计数，以保证检验结果的准确性。

总之，对于抗凝剂依赖性假性PLT减少，临床较常见的为EDTA-PTCP，对两种抗凝剂均存在依赖性假性PLT减少的病例非常罕见，在实际工作中若遇到此种情况，应采用手工稀释法计数进行复核，以避免因PLT假性减少引起的误诊、误治，为临床提供准确、可靠的治疗依据。

1Cohen AM，Cycowitz Z，Mittelman M，et al.The incidence of pseudothrombocytopenia in automatic blood analyzers.Haematologia（Budap），2000，30:117-121.

2丁邦显，刘思景.抗凝剂EDTA-K2引起的血小板减少原因分析.检验医学与临床，2011，8:2357-2358，2360.

3刘学斌，邹雪梅，黄冬梅，等.两种抗凝剂对血小板的影响因素临床分析.河北医学，2013，19:1595-1597.

4Bragagni G，Bianconcini G，Brogna R，et al.Pseudothrombocytopenia:clinical comment on 37 cases.Minerva Med，2001，92:13-17.

5Rao GH，Peller JD，White JG.Influence of ionized calcium on thrombin-induced down regulation of GPIb/IX receptors on human platelets.Thromb Res，1997，85:23-31.

6Bizzaro N，Brandalise M.EDTA-dependent pseudothrombocytopenia. Association with antiplatelet and antiphospholipid antibodies.AM J Clin pathol，1995，103:103-107.

7王伟，王海梅，杨萍，等.EDTA-K2和枸橼酸钠同时依赖的假性血小板减少病例分析.中华全科医学杂志，2013，11:786-787.

8徐秀湖，朱洁琳.EDTA-K2和枸橼酸钠1∶4抗凝剂均引起血小板假性减少1例报道.实验与检验医学，2014，32:362-364.

9邝妙欢，刘晓华，钟义富，等.EDTA依赖性假性血小板减少症血小板的检测.国际检验医学杂志，2010，31:1224-1225，1228.

（本文编辑:张志成）

10.3969/j.issn.1674-7151.2015.04.017

（2015-10-13）