我国HCV主要基因型优势抗原表位的筛选

万祥辉　杨细媚　邹学森

检验与临床

我国HCV主要基因型优势抗原表位的筛选

万祥辉杨细媚邹学森

作者单位:330029南昌市，江西省肿瘤医院检验科（万祥辉邹学森）330030南昌市，江西省儿童医院检验科（杨细媚）

目的针对我国丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）主要基因型筛选出能有效诱导体液免疫和细胞免疫的抗原多肽。方法利用生物信息学方法预测评估我国HCV主要基因型1b、2a、6a型的优势B、CTL和Th抗原表位。以HCV-CTL、HCV-B+HCV-Th、HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th组合肽作为免疫原免疫BALB/C小鼠，经乳酸脱氢酶释放法检测CTL杀伤活性、ELISPOT法检测分泌IFN-γ能力、ELISA法检测抗体滴度，对检测结果进行统计学分析。结果SP2/0对照细胞未产生特异性免疫应答，而SP2/0-NS3实验细胞HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th和HCV-CTL均诱导了特异性的CTL应答，且当效靶比为25∶1和50∶1时，三组间差异均有统计学意义 （F=2045，F=6338，P均＜0.05），且HCVCTL+HCV-B+HCV-Th联合免疫激活的CTL活性高于HCV-CTL单独免疫，HCV-CTL单独免疫高于PBS空白对照，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。细胞体液联合免疫、单独体液免疫、单独细胞免疫刺激的分泌IFN-γ的细胞数量差异有统计学意义（F=5308，P＜0.05）。单独体液免疫、单独细胞免疫刺激的分泌IFN-γ的细胞数量均低于细胞、体液联合免疫，单独体液免疫刺激的分泌IFN-γ的细胞数量高于单独细胞免疫，且差异均有统计学意义（P均＜0.05）。不同时间点不同免疫原所诱导的特异性的IgG抗体滴度差异均有统计学意义 （P均＜0.01）。不同时间点用HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th联合免疫和HCV-B+HCV-Th免疫所诱导的特异性IgG抗体滴度均显著高于PBS空白对照，且差异均有统计学意义（P均＜0.05），而细胞体液联合免疫与单独体液免疫之间特异性IgG抗体滴度经比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th联合免疫诱导了高效的体液免疫和细胞免疫应答，有望进一步开发为有效的重组HCV疫苗。

丙型肝炎病毒；多价疫苗；基因型；联合免疫

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）为单正链RNA病毒，是慢性肝病的主要病原体，全球约有1.7亿HCV感染患者，我国HCV感染率为3.2%，感染者约3800万［1］。目前对于慢性HCV感染，主要治疗手段是长效干扰素联合利巴韦林的抗病毒治疗，有效率仅约为50%。因此，研制安全有效的预防性及治疗性HCV疫苗意义重大。至今仍未研制成功安全有效的HCV疫苗，一个重要原因是HCV具有高度变异性。基因型研究［2］显示，HCV基因型分布具有区域性特点，我国除西南和港澳地区以6a型较多外，其他地区以1b、2a型为主。HCV基因同源性分析［3］显示，不同基因型间基因组核苷酸差异大于30%，不同亚型间差异大于20%，但同一亚型间不同分离株是相对保守的，氨基酸同源性大于80%，这使设计针对不同基因型HCV的多重表位成为可能。参与细胞免疫的主要有CD4+Th和CD8+CTL细胞，其中CTL可以直接杀伤病毒感染的细胞，Th细胞在CTL的激活以及维持中发挥着重要作用，同时激活这两种细胞是理想的疫苗设计策略［4］。除了细胞免疫之外，体液免疫对HCV感染也具有一定的预防作用［5］。为此本文研究针对我国HCV主要基因型分别预测CTL、B和Th表位抗原，利用生物信息学设计筛选出能有效诱导体液和细胞免疫应答的多重HCV表位抗原，并通过动物实验验证表位抗原的免疫应答效果，为HCV疫苗研制提供实验基础。

1　材料与方法

1.1材料碱性磷酸酶标记的IgG二抗为Caltag Laboratories Inc.公司产品，LDH细胞毒性检测试剂盒为BioVision公司产品，ELISPOT试剂盒为 ImmunoWay公司产品。铝盐佐剂alhydrogel为丹麦产品，96孔PVDF滤膜板为Millipore产品。6周龄BALB/c小鼠购自南昌大学实验动物中心。SP2/0细胞及稳定表达HCV-NS3蛋白的SP2/0-NS3细胞由南昌大学医学院何明教授馈赠。

1.2表位设计、合成以1b型的中国河北株（ABU97067），2a型的美国株 （AAF01178），6a型的中国香港株（ABE98157）为分析对象，采用单参数方案（Kyte-Doolittle［6］亲水性、Karplus-Schulz［7］柔韧性、Emini［8］表面可及性和Jameson-Wolf［9］抗原指数）分别预测我国HCV主要基因型的抗原表位。综合单参数预测结果后经PORTER［10］（http://distill.ucd.ie/ porter/）二级结构筛选，结合表位抗原指数得分（AI）和保守性分析［11］，最终确定优势B细胞表位。用BIMAS［12］、SYFPEITHI［13］预测含HLA-A＊0201的CTL限制性表位及含HLA-DRB1＊0301的Th限制性表位。选择1b、2a、6a基因型最佳的B、CTL、Th细胞表位，串联成HCV-CTL、HCV-Th、HCV-B，委托上海强耀多肽生物公司合成，其纯度均大于95%。

1.3动物实验共分四组，每组12只小鼠，以20% alhydrogel为佐剂，分别用 200 μl HCV-CTL（50 μg）、HCV-B+HCV-Th（50 μg）、HCV-CTL+HCV-B+ HCV-Th（50 μg）和PBS皮下多点免疫小鼠，3 w免疫1次，共免疫3次。

1.4乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）释放法检测CTL杀伤活性最后一次免疫后10 d每组杀死6只小鼠，取脾细胞，用20 μg HCV-CTL体外刺激脾细胞5 d得效应细胞，将效应细胞与靶细胞SP2/0-NS3按效靶比50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1加载到96孔细胞培养板中，SP2/0细胞作为对照细胞，同时设置靶细胞SP2/0-NS3自然释放LDH孔和最大释放LDH孔，37℃，5%CO2共培养6 h，根据LDH释放试剂盒说明书提供公式检测CTL活性。特异性细胞杀伤率（%）=（试验组A值-自然释放组A值）/（最大释放A值-自然释放组A值）×100%。

1.5ELISPOT法检测分泌IFN-γ的细胞按试剂盒说明书操作:在96孔滤膜板中加100 μl/孔的70%乙醇，室温放置10 min，倒掉乙醇，用PBS或包被缓冲液洗涤；加100 μl/孔适当稀释的捕获抗体，4℃包被过夜；倾空板子，用包被缓冲液洗涤2次，加200 μl/孔RPMI 1640完全培养基，室温封闭1 h；弃液，加入100 μl/孔用RPMI 1640稀释的刺激物（抗原或丝裂原）；每孔加入100 μl细胞（106个/孔），在37℃，5%CO2培养箱中培养36 h；将培养物倒掉，拍干，用PBST洗涤3次，加100 μl/孔生物素标记的检测抗体，室温放2 h。弃液，用PBST洗涤4次，加100 μl/孔亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温放置45 min，洗涤，加100 μl/孔新配置的AEC（3-amino-9-ethyl carbazole）底物液，室温显色10-60 min，观察斑点形成。加200 μl/孔蒸馏水洗板3次终止反应。自然干燥，用读板机读板。

1.6ELISA法检测抗体滴度第一次免疫后20 d、41 d和52 d取血分离血清。用HCV-B包被酶标板，免疫血清为一抗，羊抗鼠碱性磷酸酶标记的IgG为二抗，采用标准的ELISA程序操作。ELISA滴度表示为最后稀释度的对数，A≥0.15并且至少是阴性对照的2倍判定为阳性。

1.7统计学处理采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料以x±s表示，多组间计量资料的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1优势抗原表位合成按照抗原表位合成方法，综合评估合成结果，选取1b型NS5A 2317（PPTTAPPVPPPRRKR），2a型NS5A 2317（PPPRKTPTPPPRRRR），6a型Core 5（PKPQRKTKRNTNRRP）组合成多肽 HCV-B；1b型 NS3 838（FLARLIWWL），2a型P7 769（FLYFVIFFV），6a型NS5B 2972（KLDLSNWFV）组合成多肽HCV-CTL；1b型NS4A 1691（SPAIVPDREVLYQDF），2a型 NS4A 1695（RAVVAPDKEVLYEAF），6a型 NS5A 1989（VCTVLSDFKVWLQAK）组合成多肽HCV-Th。

2.2LDH释放法检测联合免疫激活的CTL活性SP2/0对照细胞未产生特异性免疫应答，而SP2/0-NS3细胞经HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th和HCVCTL均诱导了特异性的CTL免疫应答，当效靶比为25∶1和50∶1时，组间差异均有统计学意义（F=2045，F=6338，P均＜0.05），且HCV-CTL+HCV-B+HCVTh联合免疫激活的CTL活性高于HCV-CTL单独免疫，HCV-CTL单独免疫高于PBS空白对照，差异均有统计学意义（P均＜0.05），见表1、图1。

表1　不同免疫原激活的CTL特异性杀伤活性检测结果比较

表1　不同免疫原激活的CTL特异性杀伤活性检测结果比较

注:＊与PBS空白对照比较，P均=0.00；#与HCV-CTL免疫原比较，P均=0.00

免疫原　25∶1　50∶1 HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th　42.60±0.82＊#　62.25±0.60＊#HCV-CTL　28.40±1.01＊　31.95±0.93＊PBS空白对照　9.95±0.82　11.08±0.81 F值　2045　6338 P值　0.00　0.00

图1　不同免疫原免疫BALB/C小鼠诱导的CTL免疫应答

2.3分泌IFN-γ的细胞数量小鼠体内经细胞体液联合免疫、单独体液免疫、单独细胞免疫刺激后分泌IFN-γ的细胞数量差异有统计学意义 （F=5308， P＜0.05）。单独体液免疫、单独细胞免疫刺激后分泌IFN-γ的细胞数量均低于细胞体液联合免疫，单独体液免疫刺激后分泌IFN-γ的细胞数量高于单独细胞免疫，且差异均有统计学意义（P均＜0.05），见表2、图2。

表2　不同免疫原在小鼠体内刺激产生的分泌IFN-γ的细胞数比较

表2　不同免疫原在小鼠体内刺激产生的分泌IFN-γ的细胞数比较

注:＊与HCV-B+HCV-Th免疫原比较，P=0.00，0.01；#与HCV-CTL免疫原比较，P=0.00

免疫原　分泌IFN-γ的细胞数　F值　P值HCV-CTL+HCV-B +HCV-Th　98.0±2.37＊#5308　0.00 HCV-CTL　18.5±0.73＊HCV-B+HCV-Th　15.9±1.12

2.4联合免疫诱导的体液免疫应答结果不同时间点不同免疫原所诱导的特异性IgG抗体滴度差异均有统计学意义（P均＜0.01）。不同时间点用HCVCTL+HCV-B+HCV-Th联合免疫和HCV-B+HCVTh免疫所诱导的特异性IgG抗体滴度均显著高于PBS空白对照诱导的特异性IgG抗体滴度，且差异均有统计学意义（P均＜0.05），细胞体液联合免疫与单独体液免疫之间特异性IgG抗体滴度差异无统计学意义（P＞0.05），见表3，图3。

图2　重组蛋白抗原在小鼠体内刺激产生的IFN-γ分泌细胞

表3　不同免疫原诱导的特异性IgG抗体滴度比较

表3　不同免疫原诱导的特异性IgG抗体滴度比较

注:＊与 PBS空白对照比较，P20d均=0.00，P41d均=0.00，P52d均= 0.00；#与HCV-B+HCV-Th免疫原比较，P20d=0.16，P41d=0.64，P52d= 1.00

免疫原　2 0 d　4 1 d　5 2 d H C V -C T L + H C V -B + H C V -T h　3 . 3 3 ± 0 . 1 9＊#　4 . 6 8 ± 0 . 1 6＊#　5 . 2 2 ± 0 . 1 5＊#H C V -B + H C V -T h　3 . 5 2 ± 0 . 3 1＊　4 . 7 2 ± 0 . 1 2＊　5 . 2 2 ± 0 . 1 1＊P B S空白对照　1 . 1 5 ± 0 . 1 1　1 . 2 2 ± 0 . 0 8　1 . 2 3 ± 0 . 0 8 F值　2 2 3 . 9　1 6 1 7 . 9　2 2 6 6 . 7 P值　0 . 0 0　0 . 0 0　0 . 0 0

图3　不同免疫原诱导的特异性IgG抗体滴度

3　讨论

多表位疫苗也称鸡尾酒式疫苗，是指同时携带多个目标抗原相关的以及辅助性表位的疫苗。与其他疫苗相比，多表位疫苗能克服主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子的遗传限制，由于一个特定表位只能被一部分人的MHC分子结合并呈递给T细胞，因此单表位疫苗通常不能在所有个体中引起预期的免疫反应，而多表位疫苗则可以被多种遗传背景的MHC分子识别并结合，从而得到高效呈递；多表位疫苗能有效应付病原微生物的变异和免疫反应中的一些不利因素；另外多表位疫苗在诱导细胞免疫方面有独特的优势。近年来，多表位疫苗已在多种病原体的疫苗设计中得到应用［14-16］。本文研究采用生物信息学方法预测获得HCV优势抗原表位，并选取我国常见3种HCV基因型最佳B、CTL、Th表位串联成多价表位，可以最大程度地针对我国HCV感染者产生有效的免疫应答，经后续的动物实验对该方法的临床应用价值进行了良好的印证。

细胞免疫和体液免疫在控制HCV感染中均发挥着重要作用。本文研究将诱导细胞免疫应答的重组抗原HCV-CTL和诱导体液免疫的重组抗原HCV-B联合免疫，以期能够寻找到能够有效产生特异性免疫应答的多肽抗原表位，为HCV重组多肽疫苗的研制提供实验基础。

CTL在病毒清除的过程中是一种重要的效应细胞。本文2.2研究结果显示，SP2/0-NS3细胞经HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th和HCV-CTL均诱导了特异性的CTL应答，当效靶比为25∶1和50∶1时，HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th联合免疫激活的CTL活性高于HCV-CTL单独免疫，且差异均有统计学意义（P均=0.00），表明联合免疫增强了HCV-CTL所诱导的特异性CTL应答，这对于清除体内已经被HCV感染的细胞非常有利。

IFN-γ是抗病毒感染过程中免疫应答产生的主要效应因子，只由活化的T细胞和自然杀伤细胞产生。本文2.3研究结果显示，经HCV-CTL+HCV-B+ HCV-Th免疫后的小鼠体内产生的分泌IFN-γ的细胞数明显高于经HCV-CTL及HCV-B+HCV-Th免疫后产生的分泌IFN-γ的细胞数，且差异均有统计学意义（P均=0.00），提示细胞、体液联合免疫可明显增加分泌IFN-γ的效应细胞，从而更有利于病毒的清除。

体液免疫在抗病毒感染过程中发挥着重要的作用，B细胞是体液免疫的效应细胞，主要通过分泌特异性抗体来完成免疫过程。本文2.4研究结果显示，HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th联合免疫诱导的特异性IgG抗体滴度与HCV-B+HCV-Th免疫诱导的特异性IgG抗体滴度差异无统计学意义 （P＞0.05），且其均高于PBS空白对照免疫诱导的特异性IgG抗体滴度，表明HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th联合免疫诱导了强烈的体液免疫应答，且T细胞表位抗原在联合免疫中不影响B细胞表位抗原的免疫原性。另外，研究结果还显示，随着时间的延长，不同免疫原所诱导的特异性IgG的抗体滴度均有增高的趋势。

韦三华等［17］等关于丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构建及其免疫原性的研究结果显示，将含HCV截短 C基因、HVRI模拟表位基因及 NS3、NS4、NS5的优势Th与CTL表位基因串联，构建的HCV多表位抗原基因疫苗能够诱发小鼠体内产生高滴度的抗体及特异性的CTL应答，并且试验组诱导的细胞因子IFN-γ水平亦高于空白对照组，差异有统计学意义，与本文研究结果基本一致，提示多表位疫苗确实可以提高机体抗原提呈效率，补充单一抗原的相应缺陷。

本文研究利用生物信息学方法筛选出我国HCV主要基因型1b、2a、6a型的优势抗原表位，并组合成HCV-CTL、HCV-B+HCV-Th、HCV-CTL+ HCV-B+HCV-Th抗原多肽，经LDH释放法检测CTL杀伤活性、ELISPOT法检测分泌IFN-γ能力、ELISA法检测抗体滴度验证，获得了能有效产生特异性免疫应答的多肽抗原表位，为HCV重组多肽疫苗的研制提供了实验基础。

1Shepard CW，Finelli L，Alter MJ.Global epidemiology of hepatitis C virus infection.Lancet Infect Dis，2005，5:558-567.

2Chen YD，Liu MY，Yu WL，et al.Hepatitis C virus infections and genotypes in China.Hepatobiliary&Pancreat Dis Int，2002，1:194-201.

3Jia L，Yu J，Yang J，et al.HCV antibody response and genotype distribution in different areas and races of China.Int J Biol Sci，2009，5: 421-427.

4Chmielewska AM，Naddeo M，Capone S，et al.Combined adenovirus vector and hepatitis C virus envelope protein prime-boost regimen elicits T Cell and neutralizing antibody immune responses.J Viol，2014，88:5502-5510.

5Khan AG，Whidby J，Miller MT，et al.Structure of the core ectodomain of the hepatitis C virus envelope glycoprotein.Nature， 2014，509:381-384.

6Kyte J，Doolittle RF.A simple method for displaying the hydropathic character of protein.J Mol Biol，1982，157:105-132.

7Karplus PA，Schultz GE.Prediction of chain flexibility in proteins. Naturwissenschaften，1985，72:212-213.

8Emini EA，Hughes J，Perlow D，et al.Induction of hepatitis A virusneutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide.J Virol，1985，55:836-839.

9Jameson BA，Wolf H.The antigenic index:a novel algorithm for predicting antigenic determinants.CABIOS，1988，4:181-186.

10Pollastri G，McLysaght A.Porter:a new，accurate server for protein secondary structure prediction.Bioinformatics，2005，21:1719-1720.

11WU Yuzhang，ZHU Xihua.A new approach for B-cell epitope prediction in viral proteins.Chinese Sci Bull，1995，40:761-763.

12Parker KC，Bednarek MA，Coligan JE.Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains.J Immunol，1994，152:163-175.

13Rammensee H，Bachmann J，Emmerich NP，et al.SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs.Immunogenetics，1999，50:213-219.

14Sun P，Ju H，Liu Z，et al.Bioinformatics resources and tools for conformational B-Cell epitope prediction.Comput Math Methods Med，2013，2013:529-543.

15Kringelum JV，Lundegaard C，Lund O，et al.Reliable B cell epitope predictions:impacts of method development and improved benchmarking.PloS Comput Biol，2012，8:e1002829.

16Dall'antonia F，Pavkov-Keller T，Zangger K，et al.Structure of allergens and structure based epitope predictions.Methods，2014，66: 3-21.

17韦三华，尹文，雷迎峰，等.丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构件及其免疫原性.中国生物制品学杂志，2007，20:633-636.

（本文编辑:陈淑莲）

Screening of dominant epitopes of HCV in China

WAN Xiang-hui1，YANG Xi-mei2，ZOU Xue-sen1.1Department of Clinical Laboratory，Cancer Hospital of Jiangxi Province，Nanchang 330029，China2Department of Clinical Laboratory，Children＇s Hospital of Jiangxi Province，Nanchang 330030，China

ObjectiveTo screen the antigen peptides of hepatitis C virus（HCV）which can effectively induce humoral and cellular immunity based on the major genotypes in China.MethodsThe B，cytotoxic T lymphocyte（CTL）and Th cell epitopes of HCV main genotype 1b，2a and 6a in China were predicted by bioinformatics methods.BALB/C mice were immunized with HCV-CTL，HCV-B+HCV-Th and HCV-CTL+ HCV-B+HCV-Th.CTL activity was assessed by LDH assay kit.IFN-γ cells were quantified using ELISPOT kit.Antibody titers were detected by ELISA assay.The results were analyzed statistically.ResultsThere was no specific immune response in control group.There were statistical significance in the difference of CTL activity among three groups at different titer（F=2045，F=6338，Pall＜0.05）.The CTL activity activated by HCVCTL+HCV-B+HCV-Th was higher than that of HCV-CTL，and HCV-CTL was higher than that of PBS，and the differences all had statistical significance（Pall＜0.05）.There was statistical significance in the difference of IFN-γ-secreting cells among HCV-CTL，HCV-B+HCV-Th and HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th immune groups（F=5308，P＜0.05）.There were statistical significance in the differences of IFN-γ-secreting cells between each two groups（Pall＜0.05）.There were statistical significance in the difference of specific IgG titer among HCV-B+HCV-Th group，HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th group and PBS group at different time（Pall＜0.01）.The specific IgG titer induced by HCV-B+HCV-Th and HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th were all higher than that of PBS，and the differences all had statistical significance at different time（Pall＜0.05），but there were no statistical significance between HCV-B+HCV-Th and HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th at different time（P＞0.05）.ConclusionCo-immunization with HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th can induce high effective immune response.HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th is potential as a recombinant HCV vaccine.

HCV；Multi-epitope antigen；Genotypes；Co-immunization

江西省科技厅项目（20122BAB215033）

10.3969/j.issn.1674-7151.2015.04.010

（2015-10-16）