铁观音茶水浸出物组成模式及溶出规律的核磁共振波谱分析

刘晓莎，董继扬，孟维君，吴志丹，许晶晶*（.厦门大学电子科学系/福建省等离子体与磁共振研究重点实验室，福建 厦门 36005；.福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 35505）

铁观音茶水浸出物组成模式及溶出规律的核磁共振波谱分析

刘晓莎1，董继扬1，孟维君1，吴志丹2，许晶晶1*
（1.厦门大学电子科学系/福建省等离子体与磁共振研究重点实验室，福建 厦门 361005；2.福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015）

利用核磁共振波谱技术检测铁观音茶汤的水浸出物，研究水浸出物随冲泡次数的变化规律，并结合多变量统计方法，研究浓香型和清香型铁观音茶叶的水浸出物在组成模式上的差异。实验结果表明：茶汤中水浸出物的浸出量随冲泡次数快速下降，大部分水浸出物在第5道茶汤中的浸出量已不足10%；不同道茶汤中水浸出物的组成模式存在明显差异，从而导致各道茶汤在口感上的迥异；此外，浓香型和清香型茶汤中水浸出物的组成模式也存在显著差异：与清香型茶汤相比，浓香型茶汤中的表儿茶素、蔗糖等物质的相对含量较高，而茶氨酸、异亮氨酸、表儿茶素没食子酸酯、奎尼酸、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯等物质的相对含量较低。

铁观音茶；水浸出物；核磁共振波谱；多变量统计分析

近年来，随着现代分析技术的快速发展，人们对茶叶生物化学性质的研究逐渐深入。越来越多的研究者利用高效液相色谱、气相色谱、以及各种色质联用等技术研究茶叶的生物化学性质与茶叶品质、加工工艺等因素的关系［1-4］。气相色谱法适合于测定具有挥发性的物质，液相色谱法更适合于测定具有生色团或官能团的物质。这两种方法在测试过程中均需要对所测物质的成分进行分离。

核磁共振（NMR）波谱作为物质化学成分和分子结构的一种常规检测技术，也已经在茶叶生物化学研究中得到应用。相比于其他检测手段，核磁共振技术能够保持样品的完整性，是一种非破坏性的检测手段；操作方法简单快速，测量精确，重复性高；检测结果受样本大小、外观等因素的影响较小；谱图中谱峰积分面积与分子中氢原子个数成正比，可用于分子的相对定量分析。英国的Gall等人［5］应用氢谱技术（1H NMR）分析不同产地的191种绿茶叶片浸出物，发现西湖龙井茶中的茶氨酸（theanine）、没食子酸（gallate）、咖啡因（caffeine）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechingallate，ECG）含量高于中国其它产地的茶叶。荷兰的Mulder等人［6］采用 NMR技术研究了饮茶对人体尿液代谢成分的影响。韩国的Hong等人［7］研究了绿茶、半发酵茶和全发酵茶的NMR指纹图谱，发现在发酵过程中表儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、ECG、EGCG、奎尼酸（quinate）、咖啡因和蔗糖等物质的含量下降，而没食子酸（gallate）和葡萄糖含量升高。

本文利用1H NMR波谱技术对铁观音茶汤的水浸出物进行检测，分析水浸出物组成模式随冲泡次数的变化规律，探索铁观音最佳冲泡条件及水浸出物浸出规律，以期为科学饮用铁观音提供理论依据。以市场上常见的两种铁观音茶（浓香型闽南乌龙茶和清香型闽南乌龙茶）为试验材料，结合多变量统计分析方法，比较了两种不同工艺的铁观音茶叶水浸出物成分的差异。本研究的结果可以为茶叶品质鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集与制备

本实验样品包括2013年秋季同一级别（由专业评茶师综合审评）的浓香型和清香型铁观音茶样品各6种，由福建省安溪县剑斗镇广茗茶叶合作社提供，茶样均产自安溪县剑斗镇福斗村。从制作工艺上，浓香型铁观音是在传统工艺炒制的清香型茶叶基础上经过烘焙再加工而成的。每个茶叶样品称重3 g，茶与水的比例为1：30，即90 mL的纯净水（怡宝牌）。将茶叶放入杯子中，加入90 mL的100℃纯净水冲泡3 min，取第1道茶汤2 mL放入EP管中，倒掉杯中剩余茶汤，盖上杯盖；3 min后再加入90 mL 的100℃纯净水，冲泡3 min，取第2道茶汤2 mL放入 EP管中，倒掉杯中剩余茶汤，盖上杯盖；如此循环操作，每个茶样取5道茶汤。将茶汤样品在-4℃下以10000 r·min-1离心15 min，取上清液存于-20℃冰箱中直至NMR实验。

1.21H NMR检测与前处理

解冻茶汤样品至常温，取300 μL样品，加入300 μL含TSP的重水，混合均匀后移入5 mm核磁管中。1H NMR实验均在Varian 500 MHz谱仪上进行。实验采用基于1D NOESY序列［8］的预饱和实验，即NOESYPR（delay-90°-t1-90°-tm-90°-acquisition）进行水峰压制，t1延迟设置为4 μs，tm延迟设置为100 ms，并在2 s的脉冲延迟和混合时间中加入饱和脉冲照射以抑制水信号。实验采用5 mm HCN三共振探头，温度293 K，谱宽10 kHz，信号累加64次。

采用MestReNova软件（MestReNova Version8.0.1）对NMR时间域上的自由感应衰减（FID）数据末尾充零至32K，进行快速傅里叶变换，并手动校正谱图相位和基线。用自编软件［9］对谱图进行手动谱峰对齐，截除残余水峰（δ4.70～4.90），然后对各谱图的TSP信号峰进行积分，并以TSP峰面积为标准对各谱图的信号强度进行归一化处理，最后对δ0.50～8.50区间内的谱数据进行自适应分段积分，得到一个60×94的数据矩阵X0，矩阵X0的一行表示一个样本，一列表示一个积分段。将数据矩阵导入SIMCA-P 14.0（Umetric AB， Umea，Sweden）进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（Partial Least Square-Discriminant Analysis，PLS-DA）等多变量统计分析。

1.3 NMR定量分析

为了定量地分析茶汤中水浸出物，我们首先对全谱进行等间隔积分以克服谱峰漂移的影响，积分区间为δ0.50～8.50，间距为δ 0.002。以TSP（δ -0.10～0.10）的积分面积作为谱图归一化的标准。在NMR谱图中，某一谱峰信号的积分面积与该化合物分子中相应基团的H原子个数呈正比。为了更准确地定量，我们采用结合水峰抑制的反转恢复脉冲序列，测量谱图中的每一个共振峰的自旋晶格弛豫时间（T1），其中弛豫延迟时间（τ）设置为0.05～16 s的16个不等间隔数值，总的采样时间为22.9 s，傅里叶变换点数32 K，累加32次。

由于信号峰的积分面积正比于H原子浓度，在一张弛豫完全的NMR谱图中，化合物的浓度与内标物（TSP）的浓度关系式如下：

因此，化合物x的浓度可以表示为：

2 数据预处理

根据多因素方差分析（ANOVA）［11］，数据矩阵X0的方差可以分解为如下4部分：茶叶的香型（即制作工艺）的影响、冲泡次数的影响、香型和冲泡次数两个因素的交叉作用、以及个体差异。当研究茶叶冲泡次数对茶汤水浸出物的影响时，香型及交叉作用是干扰因素，需要加以抑制；而研究不同香型茶叶水浸出物的差别时，冲泡次数和交叉作用是干扰因素，也需要加以抑制。为此，本文对数据矩阵X0做如下的预处理：

（1）采用多因素ANOVA方法滤除香型因素和交叉作用的影响，得到新数据矩阵X1，用于研究冲泡次数对茶叶水浸出物总体浓度的影响；

（2）对数据矩阵 X1的所有样本进行面归一（Constant Sum Normalization，CSN），以消除样品整体浓度差异的影响，得到新的数据矩阵X2，用于研究茶叶水浸出物的组成模式随冲泡次数的变化规律；

（3）将对X2进行two-way ANOVA分析，滤除冲泡次数和交叉作用的影响，最后对数据矩阵进行自适应尺度缩放（Scaling）［12］，以提高与香型因素相关的水浸出物成分的权重，得到新数据矩阵X3，用于研究不同香型茶叶水浸出物的区别。

表1 数据集的方差组成Table 1 Composition of variance of dataset

各数据矩阵的方差组成如表1所示。茶叶香型的差别对数据方差（X0）的贡献比较小，在消除样品整体浓度的影响之前，香型因素的作用只占总方差的 0.4%，而冲泡次数对茶汤样品的影响高达91.5%，因此要研究茶叶香型的差异，需要滤除冲泡次数干扰。利用CSN归一化方法消除茶汤整体浓度差异之后，冲泡次数的影响大大降低了，香型差别的比重得到了提高。

3 结果与分析

3.1 茶汤中主要水浸出物

图1是铁观音茶汤样品的典型1H NMR谱。根据参考文献［13］和二维谱实验，对茶叶的一维谱进行归属。从图中可以观察到茶叶的主要水浸出物成分，如多酚类、氨基酸类、可溶糖类、生物碱类及有机物类的物质等。

3.2 茶叶冲泡次数对水浸出物浓度的影响

滤除香型和交叉作用的影响之后的数据集X1，冲泡次数的方差仍然占绝大部分，因此用主成分分析（PCA）就可以直观地表征不同冲泡次数对茶汤水浸出物的影响，如图2（a）所示。

从图中可见，同一道茶汤样本点相对聚集，而不同道茶汤样本在PCA第一主成分t［1］上具有一定的可分性。第一主成分解释了绝大部分的数据方差（96.2%），这说明了不同道茶汤样本之间的区别主要在于水浸出物的整体浓度；而随着冲泡次数的增加，总体浓度呈单调下降，且下降速度越来越小。此外，模型PC1方向上的方差比例为96.2%，也就是说整体浓度差异在数据集中占有支配地位，即不同道茶汤样本的区分主要来自于水浸出物整体浓度的贡献。

图 1 铁观音茶汤样品的1H NMR谱Fig. 1 Representative1H NMR spectrum of Tie-guanyin tea

图 2 不同冲泡次数茶样的PCA得分图Fig. 2 PCA scores of teas steeped for 5times

在实际获得的一维NMR谱图中，化合物谱峰无可避免地与其他信号峰发生重叠，直接对重叠的谱峰进行积分将直接影响定量分析的结果［14］。当化合物在谱图中多个化学位移处出现信号峰时，优先选择信噪比较高且与周围信号峰重叠较少的特征峰作为定量的依据。对本文中参与定量分析的物质，我们挑选信号峰的位置和H原子个数详见下表。

随着冲泡次数的增加，前3道茶汤浓度的变化幅度比较大，第1道茶汤水浸出物含量最多，水浸出物含量均随冲泡次数增加而减少，第4道和第5道的整体浓度变化比较小，而且很接近。分别对每一道茶汤NMR波谱中的主要水浸出物积分，以五道茶汤的总积分和作为 1，计算每一道茶汤中的各个水浸出物所占的比例，得到表 2。可以观察到随着冲泡次数的增加，茶汤中水浸出物的浸出量越来越少，整体浓度越来越小，至第5道茶汤时，大部分水浸出物的浸出率已不足10%。

表2 6种水浸出物在各道茶汤中的浸出量占该水浸出物总浸出量的比例Table 2 Extract/total extractable of 6 teas

3.3 各道茶汤中水浸出物组成模式的差异

为了进一步分析茶汤水浸出物的模式差异，我们对消除茶汤整体浓度影响后的数据矩阵 X2进行PCA分析，结果如图2（b）所示。对比X1和X2的PCA得分图，消除整体浓度差异后，不同道茶汤样本集之间的可分性降低了，但样本集在PC1方向上从右往左仍然可以按冲泡次数的顺序排列。第1道茶汤水浸出物含量仍为最高，但是低于数据集X1当中的数值。其余几道茶汤在数据集X2当中的浸出率都大于数据集X1，说明在消除整体浓度差异后，各水浸出物本身的浸出速度比较缓慢。这是由于茶叶中各组分的浸出量随冲泡次数增加而下降的速度不相同引起的。

将不同道茶汤的样本做两两PCA分析，结果如图3所示。在不同的冲泡次数的茶汤中，茶叶浸出组分的浓度比例存在一定差异，但总体变化趋势基本相同。随着冲泡次数的增加，样本集之间的组分模式差异也逐渐增大。例如：相邻两道茶汤的样本集存在部分重叠，而冲泡次数相隔越多样本集的可分性就越好，如图3第一行的4个得分图。

详细分析各道茶汤水浸出物的组成模式，可以发现几点现象：

（1）第1道茶汤中的咖啡因、茶氨酸、奎尼酸、蔗糖等成分的相对含量较高，而ECG、乙酰乙酸等成分的相对含量较低。这是由于咖啡因、茶氨酸、奎尼酸、蔗糖等成分的浸出速度较快，而ECG和乙酰乙酸的浸出速度较慢的缘故。

（2）随着冲泡次数的增加，叶片舒展更有利于内含物质的浸出，茶氨酸和儿茶素类水浸出物的相对含量逐渐升高。第2至第4道茶汤的水浸出物含量比较均衡，特别是第3道茶汤，没有发现含量特别高和特别低的成分。

（3）蔗糖在第2道茶汤中的相对含量比较高，而在第4道茶汤中的相对含量最低。

（4）到第5道茶汤时，浸出速度较快的成分均已所剩不多，因而相对含量偏低，如：咖啡因、茶氨酸、奎尼酸等。

图 3 不同道茶汤两两之间的PC1～PC2得分图Fig. 3 PC1～PC2 scores by pair-comparison between teas steeped for various times

3.4 不同香型茶叶水浸出物的差异

浓香型茶叶是传统工艺炒制的茶叶经烘焙再加工而成。由于浓香型铁观音做青程度较重，烘焙工序采用连续长时间文火慢烘，因此醇度较高、茶香和汤色较重，使得其口感醇厚、香气高长、回甘较重，近年来受到越来越多消费者的喜爱。浓香型铁观音的加工中先后经历3次烘焙［15］，第一次焙茶以80～95℃的温度烘焙8 h，以去除茶叶的青气；第二次以105℃烘焙12 h以固定浓香型铁观音独特的蜜香及火香；第三次以115℃再烘焙6 h以提香。

为了分析浓香型和清香型铁观音茶汤水浸出物的差异，对原始数据矩阵X0做面归一化处理，消除不同冲泡次数引起的浓度差异，然后再采用ANOVA方法滤除交叉作用的影响，得到数据矩阵X3。从表1中数据集X3的方差组成可见，香型因素的作用仍然只占总方差的 10.8%，很难用无监督的PCA方法进行表征，因此采用有监督的偏最小二乘-鉴别模型（PLS-DA）方法对数据集X3进行建模分析，结果如图4所示。从图4可见，清香型和浓香型铁观音茶汤样本点可以明显区分，且模型的预测能力Q2达到0.86。说明这两种香型的茶叶水浸出物存在显著差别。但模型的方差解释能力R2只有0.34，说明只有一小部分的水浸出物存在显著差异，这与表1中香型因素只占总方差的10.8%的现象吻合。结合该模型负载图以及变量对模型的贡献值（VIP），对引起两组区分的水浸出物浓度进一步半定量分析，并对结果进行t检验，如图5所示。在PLSDA模型中，与清香型茶叶的水浸出物成分相比，浓香型茶叶茶汤中的 EC和蔗糖（Suc）含量显著升高（p＜0.05），而茶氨酸（The）、异亮氨酸（Ile）、ECG、奎尼酸（Qua）和EGC/EGCG含量显著降低（p＜0.05）。

EGC/EGCG、ECG均属于儿茶素类，是茶多酚中的有效活性成分，也是决定茶汤色香味的主要成分。制茶过程中的做青工序对多酚类物质含量的影响相对较大。这些变化可能是由于以下因素综合造成的［16］：首先，多酚类物质与咖啡因之间的相互作用生成缔合物，减少多酚类物质的含量；其次，铁观音茶叶中的多酚类物质在多酚氧化酶和过氧化酶作用下被氧化和相互转化，形成不同层次的氧化产物，而酚类及其氧化物同时又与蛋白质结合沉淀导致儿茶素类含量下降；最后，多酚类的羟基接触空气后容易发生非酶促氧化，促进化学氧化剂氧化多酚的邻位二羟基形成邻醌，进而生成茶黄素类物质。在浓香型铁观音制作过程中，做青次数较清香型多，加工时间较长，因此多酚类物质含量减少比清香型更多。表儿茶素（EC）含量占茶多酚总量的60%（w/w）左右［17］，是茶汤涩味的重要因子。通常来说，发酵程度直接决定茶叶的口味。与清香型相比，浓香型铁观音通过高温烘焙，提升发酵程度，因此浓香型茶汤口感较清香型略涩，而EC含量也较高。

图 4 不同香型茶样的PLS-DA得分图（R2=0.34，Q2=0.86）Fig. 4 PLS-DA scores of lightly fragrant and strongly fragrant Tie guanyin teas

图 5 不同香型茶样的主要水浸出物的半定量分析结果Fig. 5 Semi-quantitative analysis onwater extracts of lightly and strongly fragrant tea varieties

茶叶中的茶氨酸含量一般占干茶总量的 1%左右，极易溶于水，是茶汤鲜爽度的主要因子。异亮氨酸则是茶叶中游离氨基酸的一种，对茶汤的滋味和鲜味产生积极的作用。茶汤中的游离氨基酸主要来源于铁观音加工过程中蛋白质的水解作用。炒青工序中的热作用会加速蛋白质水解，增加氨基酸含量；同时，由于茶叶加工中的加热和氧化作用，部分氨基酸会脱羧和氧化产生相应的挥发性醛类化合物提升茶叶香气。浓香型茶叶连续多次高温加热，促使茶叶中的氨基酸缓慢进行脱羧、氧化、聚合等作用，因此浓香型茶汤中的茶氨酸和异亮氨酸含量显著减少。

茶汤中呈现甜味的糖类主要是因为茶叶中含有的果糖等单糖和蔗糖、麦芽糖等双糖物质，它们对茶的苦涩味有一定的掩盖和协调作用，糖类物质含量越高，茶叶滋味越甘醇而不苦涩［18］。在核磁共振氢谱中，可以观察到浓香型铁观音茶汤中的蔗糖含量显著高于清香型茶汤；从感官上品评两种铁观音茶汤，浓香型茶汤更显醇香。

奎尼酸是茶叶中的一种重要有机酸，它不仅参与茶树的新陈代谢，在生化反应中常为糖类分解的中间产物，而且作为一种水溶性物质，在茶叶冲泡过程中可被浸出到茶汤中，成为影响茶汤香气和滋味的主要成分之一［19］。有研究表明［20］，茶叶中奎尼酸的含量变化幅度较大，与品种、鲜叶嫩度、制作工艺等均有关系。刘盼盼等［21］对绿茶的研究表明随着鲜叶嫩度的下降，奎尼酸含量呈明显下降。

4 总结

本文采用基于磁共振氢谱技术检测茶叶水浸出物的轮廓，分析了水浸出物随冲泡次数的变化，以及浓香和清香两种不同香型茶叶水浸出物的区别，为茶叶品质鉴定和规范制茶工艺提供科学量化的数据支持。借助快速高效的磁共振氢谱检测方法，测定茶叶的指纹图谱，可望用于建立不同品种、产地、年份茶叶整体化学组成的数据库，结合单变量、多变量数据分析寻找各种茶叶的特征化学成分。本文的方法同时适用于研究机体对摄入茶汤的响应，探寻与饮茶相关的内源性代谢物的改变，为茶叶等功能性饮料与食品研究提供参考。

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1H NMR Spectroscopy on Composition of Water Extract from Tie-guanyin Teas

LIU Xiao-sha1，DONG Ji-yang1，MENG Wei-jun1，WU Zhi-dan2，XU Jing-jing1*
（1.Department of Electronic Science， Fujian Provincial Key Laboratory of Plasma and Magnetic Resonance， Xiamen University，Xiamen， Fujian 361005， China； 2.Tea Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fu'an， Fujian 355015， China）

Nuclear magnetic resonance spectroscopy was applied to obtain metabolic fingerprints of the water extracts of Tie guanyin teas. By using the multivariate statistical analysis on the data obtained on the extracts from consecutive steeping， the compositional differences between the lightly and strongly fragrant varieties of the tea were compared. Overall， the concentrations of the elements in the extracts decreased with increasing number of steeping. On the 5thtea brewing， the concentrations became less than 10% of the initial amount， which invariably changed the sensory quality of the tea. There were significant differences in the chemical make ups between the lightly and strongly fragrant varieties of the tea. The strongly fragrant variety tended to have a significantly higher contents of sucrose and epicatechin， but lower of theanine， epicatechingallate， quinate， isoleucine， and epigallocatechin/epigallocatechingallate than its lightly fragrant counterpart.

Tie guanyin tea； water extract； nuclear magnetic resonance spectroscopy； multivariate statistical analysis

S571.1

A

2015-09-10初稿；2015-11-04修改稿

国家自然科学基金（81201143，81371639）；福建省自然科学基金（2015J05168，2015Y0032）。

刘晓莎（1989-），女，学士。主要从事等离子体与磁共振研究。

许晶晶（1983-），女，博士，高级工程师。主要从事食品与医学代谢组学研究。Email： jinging@xmu.edu.cn