GDNF及其受体GFRα1在小儿肾母细胞瘤中的表达及意义

张雪，田娟，赵越超，郭芳

GDNF及其受体GFRα1在小儿肾母细胞瘤中的表达及意义

张雪1，2，田娟1△，赵越超1，2，郭芳1

目的 研究胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）及GDNF受体α1（GFRα1）在小儿肾母细胞瘤中的表达及其临床意义。方法 应用免疫组织化学法检测GDNF及其受体GFRα1在30例小儿肾母细胞瘤组织及16例瘤旁正常肾组织病理石蜡标本中的表达。结果 GDNF在肾母细胞瘤中的阳性表达率高于瘤旁正常肾组织（66.7%vs 6.3%），GFRα1在肾母细胞瘤中的阳性表达率高于瘤旁正常肾组织（63.3%vs 6.3%）；两者在上皮型和胚芽成分强烈表达，在间叶成分表达较弱。GDNF及其受体GFRα1在不同组织分型、临床分期及有无淋巴结转移的患者间表达差异无统计学意义。结论 肾母细胞瘤中GDNF及其受体GFRα1的高表达可能与肿瘤的发生密切相关。

肾母细胞瘤；胶质细胞源性神经营养因子；GDNF受体α1；免疫组织化学

肾母细胞瘤是婴幼儿时期最常见的腹部恶性实体肿瘤之一，由于其发生及调控机制尚不清楚，因而在临床上难以得到有效防治及判断预后。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）属于转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成员，是目前发现的特异性最强的多巴胺能神经元营养因子［1］。GDNF受体alpha 1（GDNF family receptor alpha 1，GFRα1）是糖基化磷脂酰肌醇锚定受体，缺乏跨膜区和膜内区，通过糖基化磷脂酰肌醇附着于细胞质膜外层，与GDNF有高亲和力，为其结合受体［2］。研究表明，GDNF及其受体GFRα1在肾脏发生发育中起重要作用，可通过其信号传导通路参与输尿管芽发生及分支［3-4］，且GDNF与肾母细胞瘤的发生有关。本研究利用免疫组织化学法检测GDNF及GFRα1在肾母细胞瘤组织中的表达，并观察其与临床病理特征之间的关系，为进一步探讨GDNF信号通路参与肾母细胞瘤发生发展的调控机制奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集中国医科大学附属盛京医院2011年5月—2014年6月收治的肾母细胞瘤患儿30例，男16例，女14例，年龄5～108个月，左侧19例，右侧11例。按美国Wilms’瘤研究组（NWTS）临床分期标准［5］：Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期8例，Ⅳ期8例。组织学类型：预后良好型（FH）20例，其中混合型12例，胚芽型4例，间质型2例，上皮型2例；预后不良型（UH）又称间变型10例。有淋巴结转移16例，无淋巴结转移14例。所有患儿术前均未行化疗及免疫治疗。

1.2 标本处理 选取所有肾母细胞瘤组织，并从中任意抽取16例瘤旁正常肾组织作为对照组，组织距肿瘤≥3 cm，所有瘤旁肾组织经病理证实镜下存在正常肾小球及肾小管结构。所有标本均采用4%多聚甲醛固定，常规乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm连续切片，每例切取8张。

1.3 免疫组织化学染色方法检测GDNF和GFRα1的蛋白表达

1.3.1 主要试剂 GDNF兔多克隆抗体、GFRα1兔多克隆抗体购自Santa公司。兔二步法免疫组化检测试剂盒（PV-9001）、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自北京中杉金桥生物工程有限公司。

1.3.2 染色步骤 石蜡切片常规脱蜡至水，高压修复抗原2 min，入3%H2O2室温孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性，滴加GDNF或GFRα1兔多克隆抗体（工作液浓度1∶100），4℃过夜。滴加试剂1（聚合物辅助剂），37℃孵育30 min，滴加试剂2（辣根酶标记抗兔IgG聚合物），37℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封固，光镜下观察。上述各步骤均用0.01 mol/L PBS冲洗。采用阳性组织切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3.3 结果判定 细胞质或细胞膜呈棕黄色或棕褐色为阳性细胞，随机观察5个高倍镜视野（×400）。根据着色深浅及阳性细胞数判定：无阳性染色为（-），细胞着色浅、阳性细胞数＜25%为（+），着色较深、阳性细胞数25%～50%为（++），着色深、阳性细胞数＞50%为（+++）。将-、+视为阴性表达，++、+++视为阳性表达［6］。

1.4 统计学方法 应用SPSS 16.0统计分析软件对数据进行χ2或确切概率法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GDNF及GFRα1在肾母细胞瘤及瘤旁肾组织中的表达 肾母细胞瘤组织中，GDNF及其受体GFRα1在上皮型成分和胚芽成分呈弥散和强阳性表达，在间叶成分呈弱阳性或阴性表达，阳性部位位于胞膜或胞质。GDNF及其GFRα1在瘤旁肾组织微弱表达，其表达阳性率低于肾母细胞瘤（P＜0.01），见图1～6，表1。

2.2 GDNF及GFRα1与肾母细胞瘤临床病理特征的关系 GDNF及GFRα1在不同组织分型程度、临床分期及有无淋巴结转移分组间表达差异均无统计学意义，见表2。

Tab.1 Comparison of GDNF and GFRα1 expression in nephroblastoma and peritumor renal tissue表1 GDNF及GFRα1在肾母细胞瘤和瘤旁肾组织的表达比较 例（%）

Tab.2 The relationship between expression levels of GDNF and GFRα1 in nephroblastoma with patient’s clinical pathological features表2 GDNF及其受体GFRα1与肾母细胞瘤临床病理特征的关系 例（%）

3 讨论

肾母细胞瘤起源于未分化的后肾胚胎，是一种生长迅速的实体恶性混合肿瘤，常见于儿童。其典型病变的肿瘤细胞成分具有三相性，包括胚基细胞、幼稚的上皮组织和间叶组织细胞［7］。肾母细胞瘤发生发展的分子机制尚未明确，目前被广泛认可的是“肾源性剩余”学说［8］。该学说认为某些个体肾组织中存在胚胎期肾组织，其可能是肾母细胞瘤的瘤前病变。目前国内外研究发现多个基因与肾母细胞瘤相关，包括有WT1、WT2、WTX、WT3、WT4（FWT1）、p53、p16、肿瘤黏连素分子基因等［9-10］，但尚未获得确认。GDNF/GFRα1信号传导通路参与细胞增殖、分化、成熟和凋亡等过程。若其过度活动会导致细胞增殖，甚者诱发肿瘤。近年来有研究表明，GDNF/ GFRα1信号传导通路在肾脏发生发育过程中发挥重要作用，参与输尿管芽的分化和增殖过程。同时有研究者发现，GDNF在肾母细胞瘤组织中高表达［11-12］。本研究结果显示，肾母细胞瘤组织中GDNF及其受体GFRα1的表达明显高于瘤旁正常肾组织，说明GDNF信号通路可能因过度活动，导致后肾胚基细胞过度增殖，进而诱发肾母细胞瘤的发生，参与肾母细胞瘤的病理过程。但是，GDNF及其受体GFRα1的表达与肾母细胞瘤的组织分型、临床分期及有无淋巴结转移无明显相关性，说明GDNF信号通路对肾母细胞瘤的病理进展可能不起关键作用。肾母细胞瘤组织中，GDNF及其受体GFRα1在上皮型成分和胚芽成分呈弥散和强阳性表达，在间叶弱阳性或阴性表达，说明在肾母细胞瘤发生过程中GDNF信号通路过度活动主要促进了上皮型和胚芽成分细胞的增殖，对间叶成分影响不大。

综上所述，GDNF及其受体GFRα1的表达上调可能与肾母细胞瘤的发生密切相关。但鉴于本研究样本资料有限，GDNF信号通路在肾母细胞瘤中的调控机制还需进一步的研究，检测GDNF及其受体GFRα1蛋白异常表达有可能成为辅助诊断肾母细胞瘤的分子标志。

（图1～6见插页）

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（2014-10-28收稿 2015-01-20修回）

（本文编辑闫娟）

The expression of GDNF and GFRα1 in childhood nephroblastoma and its clinical significance

ZHANG Xue1，2，TIAN Juan1△，ZHAO Yuechao1，2，GUO Fang1
1 Department of Histology and Embryology，Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China；2 Central Hospital of Fushun
Corresponding Author E-mail：tian555juan555@sina.com

Objective To investigate the expressions of GDNF and GFRα1 in childhood nephroblastoma，and therefore its clinical significance.Methods The expression levels of GDNF and GFRα1 were examined by immunohistochemistry of 30 parrafin samples from nephroblastoma section as well as 16 parrafin samples of peritumor renal tissue.Results The positive expression rate of GDNF and GFRα1 in nephroblastoma were higher than those in normal renal tissue（66.7%vs 6.3%；63.3%vs 6.3%）.GDNF and GFRα1 were strongly expressed in epithelium and embryo bud，but weakly expressed in lobus intermedius of nephroblastoma.There was no correlation between the expressions of GDNF and GFRα1 with histological types，clinical stage and metastasis of nephroblastoma of patients.Conclusion High expression of GDNF and GFRα1 in childhood nephroblastoma might indicate its role in tumor development.

nephroblastoma；glial cell line-derived neurotrophic factor；GDNF family receptor alpha 1；immunohistochemistry

R737.1

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.013

辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2012307）；辽宁省科学技术计划项目（2013022067）；辽宁省大学生创新创业训练计划项目（201410160037）；国家大学生创新创业训练计划项目（201410160037）

1辽宁医学院组织学与胚胎学教研室（邮编121001）；2抚顺市中心医院

张雪（1982），女，硕士在读，主要从事肾脏发育与肾肿瘤疾病研究

△E-mail：tian555juan555@sina.com