年龄对骨折愈合影响的生物信息学分析

王顺义，李辉，胡长清，任东良，马伟松，李伟锋，于涛

年龄对骨折愈合影响的生物信息学分析

王顺义，李辉，胡长清，任东良，马伟松，李伟锋，于涛

目的 探索年龄对骨折愈合速度的影响，并寻找在年龄对骨折愈合速度产生影响的过程中起重要作用的基因和通路。方法 利用R编程语言，分别找到在各时间点（未骨折，骨折后3 d、1周、2周、4周和6周）26周龄大鼠和52周龄大鼠相对于6周龄大鼠的差异表达基因，通过比较这12组差异表达基因，找到能够使年龄对骨折愈合产生影响的基因，利用DAVID数据库对这些基因进行功能注释，并通过STRING数据库构建这些基因的PPI网络。结果 未骨折、骨折后2周、4周、6周，52周龄大鼠的差异表达基因均多于26周龄大鼠；骨折后6周，26周龄大鼠只有4个差异表达基因，而52周龄大鼠中有99个。这99个差异表达基因主要富集于与骨骼生长、免疫和炎症等相关的生物过程，富集的KEGG通路有2条：ECM-receptor interaction和Arachidonic acid metabolism。Pcna、Casp3 和Fn1等在PPI网络中与其他基因联系较密切。结论 Pcna、Casp3和Fn1等基因可能在骨折愈合中起重要作用，其可能通过影响ECM-receptor interaction和Arachidonic acid metabolism等通路来发挥作用。

计算生物学；骨折；年龄因素；R编程语言；通路；PPI网络

骨折是指骨结构的连续性完全或部分断裂，多见于儿童及老年人。由于老年人身体各方面功能下降，导致其对于意外伤害造成骨折等危险因素的易感性明显增加，此外老年人骨量明显减少、骨的微观结构退化以及增龄性骨质疏松等原因，其在外力的作用下更易产生骨折［1］。在影响骨折后愈合的多种因素中，年龄是一个不可忽视的全身性因素，且多数老年人在骨折前已患有骨质疏松，在骨折后，又进一步加剧了骨折愈合的难度，随着年龄的增加，患者骨折愈合所需时间、愈合程度以及成功愈合的难度等亦随之增加［2-3］。骨折愈合是一个极其复杂的生物学过程，受诸多因素的影响。Giannoudis等［4］提出骨折治疗的“钻石概念”（diamond concept），认为生长因子、骨传导支架、间充质干细胞以及机械环境是影响骨折愈合的4个主要因素。然而，老年人这一群体具有一定的特殊性，怎样促进老年人的骨折愈合，一直是骨伤科领域的重点课题之一。本研究利用公共基因芯片数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）的芯片数据，对早期和晚期骨折患者的基因表达谱进行分析，重点对年龄偏大的大鼠在未骨折及骨折后各个时间点相对于年轻的大鼠差异表达基因进行比较，进一步探讨年龄与骨折愈合之间的关系，旨在为老年人骨折治疗提供新的指导思路。

1 材料与方法

1.1 表达谱芯片 表达谱芯片数据是在美国国家生物技术中心（NCBI）的GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库中下载的编号为GSE594［5］的芯片数据，物种类型为大鼠，疾病和组织类型分别为骨折和股骨。该芯片数据包含54个样本：6周、26周和52周龄大鼠，在未骨折、骨折后3 d、1周、2周、4周和6周的样本分别有3个。该芯片数据基于GPL85 ［RG_U34A］Affymetrix Rat Genome U34 Array平台进行检测。本研究的流程图见图1。

Fig.1 The workflow of our study图1 本研究的流程图

1.2 芯片数据预处理 利用R语言的affy［6］包，进行背景校准和样本间的片间标准化，affy包进行标准化时默认的方法是 RMA；利用芯片平台的注释包（pd.rg.u34a，rgu34a.db，rgu34acdf，rgu34aprobe），把芯片上的探针符号转化为基因符号，去掉没有对应基因符号的探针，对于多个探针对应同一个基因符号的情况，取这些探针上表达值的平均值作为基因的表达值。

1.3 差异表达基因的筛选 利用R语言的limma［7］包，对芯片上检测到的所有基因在实验组和对照组之间的表达值进行t检验，并且经过Bonferroni校正，选择那些校正P＜0.05，并且log2（fold change）＞1的基因作为实验组相对于对照组的差异表达基因。本研究得到12组差异表达基因：在各个时间点（未骨折、骨折后3 d、1周、2周、4周和6周），26周和52周龄大鼠相对于6周龄大鼠的差异表达基因。

1.4 差异表达基因的功能注释 根据各组基因的数目及重合的基因找到在年龄影响骨折愈合中起重要作用的一组基因。利用DAVID［8］（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）在线工具，对这组基因进行功能注释。选择那些经过Benjamini校正后P＜0.05，并且至少富集了10个基因的GO terms以及经过Benjamini校正后P＜0.05的KEGG通路作为基因的主要富集功能。

1.5 差异表达基因PPI网络的构建 绝大多数的疾病都是由基因之间的相互作用引起的，而不是由单个基因引起。为了在系统水平上探究基因怎样使年龄对骨折的愈合产生影响，利用STRING［9］（http://www.string-db.org/）数据库构建了差异表达基因的PPI网络，选择的阈值是STRING中的默认值（综合得分≥0.4）。利用Cytoscape［10］软件对PPI网络进行了可视化，并通过求PPI网络中每个基因的节点度，即在PPI网络中与该基因有直接相互作用的基因个数，找到PPI网络中与其他基因联系较密切的基因，这些基因有可能在年龄对骨折产生影响的过程中起着较重要的作用。

2 结果

2.1 芯片数据预处理 各个箱型中的黑线基本上在同一水平线上，说明标准化效果较好，可以用于后续分析，见图2。在预处理前，芯片上总的有8 799个探针符号，经过去除没有对应基因符号的探针和对多个探针对应同一个基因符号的情况归一化处理后，还剩下5 100个没有重复的基因符号。

2.2 差异表达基因 6个时间点中有4个时间点（未骨折，骨折后2周、4周、6周）52周龄大鼠的差异表达基因均多于26周龄大鼠；骨折后6周，26周龄大鼠只有4个差异表达基因，而52周龄大鼠中有99个差异表达基因，后续对这99个差异表达基因展开分析。见图3。

Fig.3 The different expressed genes of 26 week old rat and 52 week old rats compared with 6 week old rats in every time point图3 各个时间点26周和52周龄大鼠相对于6周龄大鼠的差异表达基因

2.3 差异表达基因的功能注释 富集的GO terms 有10条，包含defense response、response to bacterium、calcium ion binding等与骨骼愈合、炎症以及免疫有关的生物过程，见表1。富集的KEGG通路有2条：ECM-receptor interaction和 Arachidonic acid metabolism。

Tab.1 Enriched GO terms of different expressed genes表1 差异表达基因富集的GO terms

2.4 差异表达基因的PPI网络 差异表达基因的PPI网络见图4。Fn1与其他基因有着较密切的联系（较大的节点度，即网络中有较多的与它有直接相互作用的基因），Tnf、Syk和Casp3等基因也有较大的节点度。网络中每个基因的节点度见表2。

Fig.4 The PPI network of the different expressed genes图4 差异表达基因的PPI网络

3 讨论

骨折是生活中最常见的疾病之一，在各年龄段都有较高的发病率［11］。骨折的愈合是患者最关注的问题之一，并且愈合速度与多因素有关。Claes等［12］证实炎症是影响骨折愈合速度的重要因素，且骨折部位固定的稳定性以及愈合部位血液的供应也是很重要的因素。本研究通过分析GEO公共数据库中关于骨折研究的大鼠mRNA表达谱数据，探究年龄对骨折愈合速度的影响，并且找到了在年龄对骨折愈合产生影响的过程中起重要作用的分子靶标及通路。与原始数据提供者的研究相比，本研究侧重于对年龄偏大的大鼠在未骨折及骨折后各时间点较年轻大鼠差异表达基因的比较，并且找到可能使年龄对骨折愈合速度产生影响的一组基因；而原始研究则分别分析了不同年龄大鼠在骨折后各时间点较未骨折大鼠基因表达谱的变化，以及不同骨折部位（如股骨、股骨干骨痂等）基因表达谱的变化。此外，笔者通过构建差异表达基因的PPI网络及对PPI网络的分析，筛选得到了可能在年龄影响骨折愈合过程中发挥作用的靶基因。

Tab.2 The degree of every gene in the PPI network表2 PPI网络中每个基因的节点度

多个研究指出年龄是影响骨折愈合的重要因素［13-14］。本研究结果显示，骨折后3 d、1周、2周和4周，26周龄大鼠和52周龄大鼠相对于6周龄大鼠的差异表达基因的数目差别都不是很大，但是在骨折后6周，26周龄大鼠只有4个差异表达基因，而52周龄大鼠有99个，提示随着年龄的增加，骨量减少，骨折愈合速度变慢。这99个基因可能是年龄对骨折速度产生影响的一个重要表现。经功能富集分析发现，这些差异表达基因主要富集于defense response、response to bacterium、calcium ion binding等与骨骼愈合、免疫和炎症等生物过程相关的功能中。Li等［15］研究指出，随着骨折愈合过程的进行，血清中钙离子的浓度会发生变化。提示这些差异表达基因所富集的功能，大部分都会参与骨折的愈合过程。另外，本研究得到ECM-receptor interaction和Arachidonic acid metabolism两条差异表达基因富集的通路；Wang等［16］研究表明ECM-receptor interaction通路是骨折愈合过程与年龄相关的重要的潜在通路；Lin等［17］研究指出Arachidonic acid metabolism能够调节骨折的愈合，与本研究结果一致。提示这两条通路在骨折愈合的过程中可能起重要调控作用。

本研究中Fn1、Pcna和Casp3等在PPI网络中与其他基因联系较为密切。Casp3蛋白是一种半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，而半胱氨酸蛋白酶主要在破骨细胞中表达，能降低脱钙骨基质，影响骨骼的愈合速度［18］。Wu等［19］研究证实Casp3表达与应力性骨折的发生相关。Pcna蛋白是一种细胞周期蛋白，与DNA损伤和细胞增殖密切相关，Wang等［20］研究指出Pcna等基因是重要的成骨增长标志物，能影响骨折的愈合过程。提示PPI网络中，这些与其他基因有密切联系的基因节点有可能是影响骨折愈合速度的重要分子靶点，且其在不同年龄的大鼠股骨细胞中差异表达，从而使年龄对骨折的愈合速度产生影响。

通过本次分析，笔者初步推断了年龄对骨折愈合速度所产生的影响，并且找到了能够使年龄对骨折愈合速度产生影响的重要的分子靶标和通路。但是，生物信息学的方法仅是提供一定的方向性指导，要确定这些分子靶点是否真的与骨折的愈合速度有关，尚需分子生物学实验进一步证明。

（图2见插页）

［1］Galli D，Vitale M，Vaccarezza M.Bone marrow-derived mesenchymal cell differentiation toward myogenic lineages:facts and perspectives［J］.Biomed Res Int，2014，2014:762695.doi:10.1155/2014/762695

［2］Lindtner RA，Tiaden AN，Genelin K，et al.Osteoanabolic effect of alendronate and zoledronate on bone marrow stromal cells（BMSCs）isolated from aged female osteoporotic patients and its implications for their mode of action in the treatment of age-related bone loss［J］.Osteoporos Int，2014，25（3）:1151-1161.doi:10.1007/s00198-013-2494-3.

［3］Plate JF，Brown PJ，Walters J，et al.Advanced age diminishes tendonto-bone healing in a rat model of rotator cuff repair［J］.Am J Sports Med，2014，42（4）:859-868.doi:10.1177/0363546513518418.

［4］Giannoudis PV，Einhorn TA，Marsh D.Fracture healing:the diamond concept［J］.Injury，2007，38（Suppl 4）:S3-6.

［5］Meyer MH，Etienne W，Meyer RA Jr.Altered mRNA expression of genes related to nerve cell activity in the fracture callus of older rats:A randomized，controlled，microarray study［J］.BMC Musculoskelet Disord，2004，5:24.doi:10.1186/1471-2474-5-24.

［6］Gautier L，Cope L，Bolstad BM，et al.Affy--analysis of Affymetrix GeneChip data at the probe level［J］.Bioinformatics，2004，20（3）: 307-315.doi:10.1093/bioinformatics/btg405.

［7］Diboun I，Wernisch L，Orengo CA，et al.Microarray analysis after RNA amplification can detect pronounced differences in gene expression using limma［J］.BMC Genomics，2006，7:252.doi:10.1186/1471-2164-7-252.

［8］Dennis G Jr，Sherman BT，Hosack DA，et al.DAVID:Database for annotation，visualization，and integrated discovery［J］.Genome Biol，2003，4（5）:P3.doi:10.1186/gb-2003-4-5-p3.

［9］Franceschini A，Szklarczyk D，Frankild S，et al.STRING v9.1:protein-protein interaction networks，with increased coverage and integration［J］.Nucleic Acids Res，2013，41（Database issue）:D808-815.doi:10.1093/nar/gks1094.

［10］Shannon P，Markiel A，Ozier O，et al.Cytoscape:a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks［J］.Genome Res，2003，13（11）:2498-2504.doi:10.1101/gr.1239303.

［11］Einhorn TA，Gerstenfeld LC.Fracture healing:mechanisms and interventions［J］.Nat Rev Rheumatol，2015，11（1）:45-54.doi: 10.1038/nrrheum.2014.164.

［12］Claes L，Recknagel S，Ignatius A.Fracture healing under healthy and inflammatory conditions［J］.Nat Rev Rheumatol，2012，8（3）: 133-143.doi:10.1038/nrrheum.2012.1.

［13］Giganti MG，Tresoldi I，Masuelli L，et al.Fracture healing:from basic science to role of nutrition［J］.Front Biosci（Landmark Ed），2014，19:1162-1175.

［14］Saran U，Gemini Piperni S，Chatterjee S.Role of angiogenesis in bone repair［J］.Arch Biochem Biophys，2014，561:109-117.doi: 10.1016/j.abb.2014.07.006.

［15］Li N，Wang MY，He L，et al.Intermittent low-dose administration of recombinant human parathyroid hormone（1-34）promotes the expression of Runx2 during early stage of fracture healing［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2009，89（11）:771-776.

［16］Wang W，Shen H，Xie J，et al.Bioinformatics analysis of time-series genes profiling to explore key genes affected by age in fracture healing［J］.Mol Biol Rep，2014，41（6）:3881-3889.doi:10.1007/ s11033-014-3255-x.

［17］Lin HN，O'Connor JP.Immunohistochemical localization of key arachidonic acid metabolism enzymes during fracture healing in mice［J］.PLoS One，2014，9（2）:e88423.doi:10.1371/journal.pone.0088423.

［18］Gentile MA，Soung do Y，Horrell C，et al.Increased fracture callus mineralization and strength in cathepsin K knockout mice［J］.Bone，2014，66:72-81.doi:10.1016/j.bone.2014.04.032.

［19］Wu AC，Kidd LJ，Cowling NR，et al.Osteocyte expression of caspase-3，COX-2，IL-6 and sclerostin are spatially and temporally associated following stress fracture initiation［J］.Bonekey Rep，2014，3:571.doi:10.1038/bonekey.2014.66.

［20］Wang CJ，Wang FS，Yang KD.Biological effects of extracorporeal shockwave in bone healing:a study in rabbits［J］.Arch Orthop Trauma Surg，2008，128（8）:879-884.doi:10.1007/s00402-008-0663-1.

（2014-11-03收稿 2015-01-12修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Using bioinformatics to analyze the effect of age on fracture healing

WANG Shunyi，LI Hui，HU Changqing，REN Dongliang，MA Weisong，LI Weifeng，YU Tao
The First Department of Orthopaedies，Baoding First Central Hospital，Baoding，Hebei 071000，China

Objective To explore the effect of age on the fracture healing through bioinformatical analysis of gene expression data in GEO，and to screen critical molecular targets and pathways involved in this process.Methods Through R programming language，we identified different expressed genes between 26/52 week old rats and 6 week old rats in every time points of the experiment（No fracture；3 days，1 week，2 weeks，4 weeks and 6 weeks after fracture）.By comparison of these different expressed genes，those genes that may contribute to fracture healing were identified.Function annotation was conducted based on DAVID database and PPI network that was constructed via STRING database.Results Compared with 6 week old rat，52 week old rat show more different genes at 2，4 and 6 weeks after fracture as well as more than intact rats.At the time point of 6 weeks after fracture，26 week old rat present 4 different genes while 52 week old rat present 99 different genes compared with 6 week old rat.We totally found 99 genes that might play important roles in the process of fracture healing.These genes involved in biological process related to bone healing，immune，inflammatory and etc.Also，two screened gene enriched KEGG pathways were identified:ECM-receptor interaction and Arachidonic acid metabolism.Through the analysis of PPI network，Pcna，Fn1，Casp3 and etc，who present high density connectivity in PPI network，were screened out.Conclusion Pcna，Casp3 and Fn1 and etc might play important roles in fracture healing through affecting ECM-receptor interaction and Arachidonic acid metabolism.

computational biology；fracture；age factors；R programming language；pathway；PPI network

Q318.04

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.010

保定市第一中心医院骨一科（邮编071000）

王顺义（1970），男，副教授，硕士，主要从事创伤骨科、骨关节科研究