鼻咽癌肿瘤干细胞高表达SOD2可对抗顺铂的杀伤作用

林碧华，陈婧，郭春连，余海波，张鑫，周克元，△

鼻咽癌肿瘤干细胞高表达SOD2可对抗顺铂的杀伤作用

林碧华1，陈婧2，郭春连3，余海波4，张鑫5，周克元1，5△

目的 探讨鼻咽癌（NPC）肿瘤干细胞对抗顺铂诱导氧化应激损伤的机制。方法 利用CCK-8法测定顺铂对NPC细胞CNE-2与NPC肿瘤干细胞CNE-2S的半数抑制浓度。观察不同浓度（0.1、0.5、1.0 μmol·L-1）顺铂作用后，细胞内活性氧（ROS）、总谷胱甘肽（GSH）的含量及总超氧化物歧化酶（SOD）的活性改变。实时定量RT-PCR测定1 μmol·L-1顺铂作用于2组细胞48 h后，谷胱甘肽合成酶（GSS）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基（GCLC）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶调节亚基（GCLM）、SOD1和SOD2 mRNA的表达情况，免疫印迹法检测SOD2蛋白的表达情况。利用小干扰RNA技术沉默SOD2，并与1 μmol·L-1顺铂共处理2组细胞，用台盼蓝染色观察细胞的存活情况。结果 顺铂对CNE-2S的半数抑制浓度显著高于CNE-2（μmol·L-1：9.8±1.1 vs 2.4±0.6，P＜0.05）。在不同浓度的顺铂处理后，2组细胞内ROS水平升高，但CNE-2S在处理前后的ROS水平均低于CNE-2（P＜0.05）。1 μmol·L-1顺铂刺激后，CNE-2S与CNE-2细胞中GSH含量均上升，但2组细胞间无明显差异（P＞0.05）；2组细胞中SOD活性均上升，且CNE-2S显著高于CNE-2（P＜0.05）。顺铂处理前后，2组细胞的GSS、GCLC、GCLM和SOD1的mRNA水平无明显差异，但CNE-2S中SOD2的mRNA及蛋白表达水平高于CNE-2（P＜0.05）。沉默SOD2与顺铂共处理2组细胞，能有效抑制其存活率。结论 NPC肿瘤干细胞CNE-2S高表达SOD2后，抗氧化应激能力增强，从而导致对顺铂的耐药。

鼻咽癌；肿瘤干细胞；顺铂；耐药；氧化应激；谷胱甘肽；超氧化物歧化酶；RNA干扰

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）为我国华南地区常见的恶性肿瘤之一，在临床治疗中通常以放疗为主并辅以适当的化疗［1］。虽然NPC患者经治疗后存活率逐年得到提升，但其复发后耐药性增加是临床遇到的更大问题。近年来发展起的肿瘤干细胞理论认为，传统的放化疗手段无法完全消除肿瘤，因其仅杀灭了已分化的低致瘤性癌细胞，而残留的真正致瘤的肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）成为复发和转移的根源［2］。

CSCs具有天然固有的多药耐药性（multidrug resistance，MDR），可通过升高抗氧化应激能力为代表的细胞内解毒能力，对抗顺氯氨铂（cisplatin，CDDP）等一线化疗药物诱导产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）而逃逸相关的凋亡及坏死［3］。然而针对NPC CSCs的MDR机制依然不清，限制了特异性针对NPC CSCs治疗方法的发展。本文通过比较NPC CSCs与母群细胞抗ROS能力及机制的异同，发现在NPC CSCs特异性高表达的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）2基因，并利用小分子RNA干扰技术，在体外初步探索针对SOD2克服NPC CSCs耐药的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料 NPC细胞CNE-2为我教研室长期传代培养及规范冻存；人NPC细胞CNE-2S为本课题组利用无血清干细胞培养基从CNE-2中用极限稀释法分离出的细胞亚群，具有肿瘤干细胞的相关特性［4］。DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）、B-27添加物及TRIzol购自Invitrogen公司；人表皮生长因子（Human epidermal growth factor，hEGF）、人碱性成纤维细胞生长因子（Human Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）购自Cell Signal Technology公司；肝素钠、CDDP购自Sigma公司；SOD检测试剂盒及CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒购自同仁化学研究所；反转录试剂盒及SYBR Green定量PCR试剂盒购自宝生物公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和SOD2小鼠抗人单抗购自Abcam公司；SOD2 siRNA（h）购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗购自Merck公司，PVDF膜、ECL发光液购自Millipore公司；BCA蛋白定量试剂盒、ROS检测试剂盒、总谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒、RIPA裂解液、5×蛋白上样缓冲液购自碧云天生物研究所。7500实时定量PCR为Applied Biosystems公司产品，多功能酶标仪为BioTek公司产品，垂直电泳系统、槽式转膜系统及冷凝CCD成像系统为Bio-Rad公司产品，FACSCantoⅡ流式细胞分析仪为BD产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将CNE-2置于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养基中，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。将CNE-2S置于含2%B-27添加物、20 μg/L hEGF、20 μg/L bFGF、10 μg/L肝素钠、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养基中，于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每次实验设3个重复孔，每组实验重复3次。

1.2.2 CCK-8法测定药物的杀伤效果 将CNE-2及CNE-2S接种至96孔板正常培养12 h后，弃去原培养基，分别加入含0.01、0.05、0.1、0.5、1、5及10 μmol·L-1CDDP的完全培养基，37℃，5%CO2饱和湿度培养48 h后。参考文献［5］中的CCK-8法测定各浓度的相对抑制率，利用Origin 8.5软件回归后求算半数抑制浓度（IC50）。

1.2.3 细胞内ROS水平检测 根据所得IC50，选定0.1、0.5 和1 μmol·L-1共3个浓度分别处理2组细胞48 h后，消化细胞，制成单细胞悬液，按说明书装载DCPH-DA探针于细胞悬液中，37℃细胞培养箱孵育20 min，PBS洗涤3次后，流式细胞仪检测FL1绿光通道信号。以正常培养的细胞作为对照，利用荧光信号中值反映ROS水平。

1.2.4 细胞内总GSH含量及SOD活性检测 按实验分组处理后，消化细胞，制成单细胞悬液计数，每组取1×107个细胞。按说明书通过多功能酶标仪测定412 nm处吸光度，利用动力学测定法求算每组样品中GSH的含量。测定450 nm处吸光度，利用标准曲线法求算每组样品SOD的活性。

1.2.5 实时定量PCR测定相关基因的mRNA表达 正常培养及用1 μmol·L-1顺铂处理细胞48 h后，TRIZol法提取总RNA。测得浓度后按PrimeScript RT reagent Kit说明书操作，进行反转录；按SYBR Premix Ex TaqⅡKit说明书操作，相关基因［SOD1、SOD2、谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSS）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基（GCLC）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶调节亚基（GCLM）］引物见表1，在7500实时定量PCR系统上，选用△△Ct相对定量法进行检测分析，以CNE-2为对照，GAPDH为内参基因，求算各目标基因的相对mRNA表达量。

Tab.1 A list of primers used in the reactions for real-time q-PCR表1 定量PCR检测相关基因的引物

1.2.6 免疫印迹法检测SOD2蛋白表达 正常培养及用1 μmol·L-1顺铂处理细胞48 h后，按文献［6］中方法加入RIPA裂解液裂解细胞，按BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，并加入5×蛋白上样缓冲液。使用SDS-PAGE蛋白电泳系统分离蛋白，湿转法电转移至PVDF膜。按抗体说明书要求封闭、孵育抗体，最后加入ECL发光液，置ChemiDoc XRS+成像系统中，检测化学发光情况。

1.2.7 小RNA干扰 当细胞生长至 70%时，按 Lipofectamine 2000说明书进行小干扰RNA（siRNA）的转染，转染前更换细胞培养液为无血清及抗生素的培养基，分别用无血清及抗生素的培养基按比例稀释Lipofectamine 2000及siRNA（包括si-SOD2及对照siRNA）并混匀，处理细胞6 h后更换为完全培养基，正常培养24 h后进行后续实验。

1.2.8 台盼蓝染色法计算细胞存活情况 按1.2.7沉默SOD2后加入顺铂继续培养48 h，消化收集细胞，用台盼蓝染液与细胞悬液等体积混匀，细胞计数板内计数透亮的活细胞及染上蓝黑色的死细胞总数，计算细胞存活情况。

2 结果

2.1 顺铂对细胞的毒性检测 顺铂对CNE-2的IC50为（2.4±0.6）μmol·L-1，低于CNE-2S的IC5（09.8±1.1）μmol·L-1，差异有统计学意义（t=15.33，P＜0.05）。

2.2 细胞内ROS水平的检测 在对照组及加入梯度浓度的顺铂处理后，CNE-2S的荧光信号均明显低于CNE-2的荧光信号，见图1。

Fig.1 Histograms show ROS level in cells treated by cisplatin图1 不同浓度顺铂处理后细胞内ROS水平比较

2.3 细胞内GSH含量的检测 对照组中 CNE-2S 与CNE-2的GSH差异无统计学意义（t=0.21，P＞0.05）。用顺铂处理后，2组细胞中GSH水平均有上升，但同一顺铂浓度处理的2组细胞间差异无统计学意义，见图2。

Fig.2 Histograms show GSH level in cells treated by cisplatin图2 不同浓度顺铂处理后2组细胞内GSH水平比较

2.4 细胞内SOD活性的检测 对照组及不同浓度顺铂处理后，CNE-2S细胞的SOD活性均高于CNE-2细胞（P＜0.05），见图3。

Fig.3 Histograms show SOD level in cells treated by cisplatin图3 不同浓度顺铂处理后2组细胞内SOD活性比较

2.5 GSS、GCLC、GCLM、SOD1和 SOD2基因的mRNA相对表达情况 正常培养CNE-2S细胞的GSS、GCLC、GCLM和SOD1 mRNA水平与CNE-2细胞无明显差异（P＞0.05），而CNE-2S组的SOD2 mRNA水平高于CNE-2组（P＜0.05）；1 μmol·L-1顺铂处理后，CNE-2S组的SOD2 mRNA水平高于CNE-2组（P＜0.05），其他基因亦无明显差异（P＞0.05），见表2、3。

Tab.2 mRNA levels including GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 in normal cultured cells were examined by real-time q-PCR表2 正常培养的2组细胞内GSS、GCLC、GCLM、SOD1 和SOD2基因的mRNA水平比较 （±s）

Tab.2 mRNA levels including GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 in normal cultured cells were examined by real-time q-PCR表2 正常培养的2组细胞内GSS、GCLC、GCLM、SOD1 和SOD2基因的mRNA水平比较 （±s）

＊P＜0.05

组别CNE-2组CNE-2S组t SOD1 1.00±0.12 0.97±0.09 0.61 n66 GSS 1.00±0.12 0.96±0.11 0.72 GCLC 1.00±0.09 1.03±0.11 0.57 GCLM 1.00±0.13 1.16±0.17 2.17 SOD2 1.00±0.11 3.02±0.19 26.58＊

Tab.3 mRNA levels including GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 in cisplatin treated cells were examined by real-time q-PCR表3 1 μmol·L-1顺铂处理后2组细胞内GSS、GCLC、GCLM、SOD1和SOD2基因的mRNA水平比较（±s）

Tab.3 mRNA levels including GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 in cisplatin treated cells were examined by real-time q-PCR表3 1 μmol·L-1顺铂处理后2组细胞内GSS、GCLC、GCLM、SOD1和SOD2基因的mRNA水平比较（±s）

＊P＜0.05

?

2.6 SOD2蛋白表达情况 CNE-2S的SOD2蛋白水平高于CNE-2，顺铂处理后SOD2蛋白表达量上升，见图4。沉默SOD2后，si-SOD2组的SOD2蛋白水平低于对照siRNA组，见图5。

Fig.4 SOD2 protein expressed in cisplatin treated cells，examined by Western blotting图4 顺铂处理后细胞内SOD2蛋白水平检测

2.7 沉默SOD2增强顺铂对NPC细胞的杀伤作用 相对于对照siRNA处理，si-SOD2与顺铂联用能显著杀伤CNE-2及CNE-2S细胞（P＜0.05），见表4。

Fig.5 SOD2 protein expressed in SOD2 silenced cells，detected by Western blotting图5 沉默SOD2后细胞内SOD2蛋白水平检测

Tab.4 Cell viability was detected by trypan blue staining表4 台盼蓝染色法检测细胞存活情况 （±s）

Tab.4 Cell viability was detected by trypan blue staining表4 台盼蓝染色法检测细胞存活情况 （±s）

＊P＜0.05

组别CNE-2组CNE-2S组n 66细胞存活率（%）对照siRNA+顺铂32.4±5.2 53.2±8.3沉默SOD2+顺铂13.7±4.1 39.4±6.7 t 7.73＊12.86＊

3 讨论

众多研究证明，NPC组织和细胞中存在CSCs，且CSCs具有持续的自我更新能力、更强的体内致瘤性及耐药性增强等特性［7-8］。CSCs能通过多种机制产生MDR，包括：增强药物外排能力，增强细胞解毒能力，增强DNA修复能力，激活抗凋亡相关信号通路等［9］。本研究发现，利用悬浮培养法从NPC细胞CNE-2中分离得到的具有CSCs特性的CNE-2S细胞，对顺铂具有更强的耐受能力，且具有更强的ROS消除能力。在NPC的放化疗治疗过程中，化疗药物和放射线能诱导细胞产生大量的ROS，无法被清除的ROS能破坏细胞内生物大分子，进而通过多种途径导致细胞凋亡，这是放化疗杀灭肿瘤细胞的作用机制之一［10］。

GSH是一种含巯基活性三肽，能作为底物与顺铂等抗肿瘤药物结合，或直接与自由基等反应而发挥解毒作用［11］。本研究发现，虽然顺铂能诱导CNE-2S与CNE-2细胞内产生更多的GSH，但同一顺铂浓度作用下，2组细胞内GSH的含量并无明显差别，提示虽然顺铂能诱导肿瘤细胞增加GSH，但与NPC肿瘤干细胞耐药无直接关系。为进一步从基因调控水平验证此推断，本研究用实时定量PCR技术检测了与GSH合成有关的3个基因GSS、GCLC和GCLM的表达情况。结果显示，顺铂能诱导2组细胞上调GSH合成相关基因的转录，但CNE-2S与CNE-2间无明显差异。笔者初步推测NPC肿瘤干细胞群CNE-2S相对于母群细胞对抗顺铂杀伤作用的增强，可能为非依赖GSH的机制。

SOD是生物体内重要的抗氧化酶，能够催化超氧化物通过系列反应最终生成氧气和水，从而保护细胞免受ROS的损害［12］。本研究发现，顺铂能诱导NPC细胞内总SOD的活性增强，且CNE-2S细胞内SOD的活性高于母群细胞CNE-2，提示NPC肿瘤干细胞耐药特性可能与细胞高表达SOD有关。人体细胞中的SODs包括3种同工酶：位于胞浆的铜锌超氧化物歧化酶（Cu-Zn-SOD，SOD1），位于线粒体的锰超氧化物歧化酶（MnSOD，SOD2）和分泌到细胞外的细胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD，SOD3）。为了从基因调控水平验证SOD与NPC肿瘤干细胞耐药有关，本研究进一步检测了SOD1、SOD2基因的mRNA水平，发现顺铂能上调SOD2的转录及翻译，对SOD1的转录并无显著影响，且CNE-2S相对于CNE-2高表达SOD2，免疫印迹对SOD2蛋白表达水平的验证与mRNA水平结果一致。此外，Feng等［13］通过蛋白质组学分析提出，通过检测肿瘤组织中SOD2表达量能对患者放疗效果进行预测。综上结果表明，具有CSC特性的CNE-2S细胞可能通过高表达SOD2抑制了顺铂诱导的ROS，从而增强了对顺铂的抗杀伤作用。

为初步探讨抑制SOD2能否逆转CNE-2S对顺铂的耐药，本研究利用siRNA技术沉默2种NPC细胞中SOD2的表达，并联用顺铂处理细胞后发现，沉默SOD2能增强顺铂对NPC肿瘤干细胞及母群细胞的杀伤作用。此外，Qu等［14-15］分别通过微小RNA （microRNA）及小发夹RNA（shRNA）技术沉默NPC细胞中CNE-1及CNE-2的SOD2表达，均能增强发射线对2组细胞的杀伤作用。综上实验结果显示，特异性沉默SOD2能增强放化疗对NPC细胞的杀伤。但本研究结果显示，沉默SOD2并不能完全逆转CNE-2S对顺铂的敏感，提示SOD2的过表达虽是NPC肿瘤干细胞CNE-2S对顺铂耐药的机制之一，但可能还有其他机制。

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（2014-12-05收稿 2015-02-12修回）

（本文编辑 闫娟）

Nasopharyngeal carcinoma stem cells develop resistant against Cisplatin through upregulating SOD

LIN Bihua1，CHEN Jing2，GUO Chunlian3，YU Haibo4，ZHANG Xin5，ZHOU Keyuan1，5△
1 Department of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Medical College，Dongguan，Guangdong 523808，China；2 Department of Pharmacy，Dongguan People's Hospital；3 Department of Pharmacology，Guangdong Medical College，Dongguan；4 Centre for Tender and Bidding，Guangdong Medical College；5 Key Laboratory for Medical Molecular Diagnostics of Guangdong Province
△Corresponding Author Email:kyz009@126.com

Objective To investigate the way that nasopharyngeal carcinoma（NPC）and NPC stem cells develops resistance to cisplatin through anti-reactive oxygen species mechanism.Methods Using CCK-8 cell counting kit，we measured the half inhibitory concentration of cisplatin against NPC cells"CNE-2"and NPC stem cells"CNE-2S"，and compared their resistant index.We examined the differences in the reactive oxygen species（ROS）levels，total glutathione（GSH）levels，and total superoxide dismutase（SOD）levels between CNE-2 and CNE-2S at different concentrations of cisplatin administration（0.1，0.5 and 1.0 μmol·L-1）.Using q-PCR，we determined the mRNA expression level of GSS，GCLC，GCLM，SOD1 and SOD2 after 48 hours administration of cisplatin at 1 μmol·L-1.Protein expression level of SOD2 was also tested using Western Blot after 48 hours administration of cisplatin at 1 μmol·L-1.Upon silencing the SOD2 in NPC cell through siRNA，Trypan blue was used to analyze cell survival after cisplatin was administrated at 1 μmol·L-1.Results The inhibition concentration of cisplatin against CNE-2 was higher than that against CNE-2S（μmol·L-1：9.8±1.1 vs 2.4±0.6，P＜0.05）.ROS levels in CNE-2 and CNE-2S both rise with cisplatin administration，but ROS levels of CNE-2 before and after cisplatin treatment were both higher than those in CNE-2S（P＜0.05）.The total glutathione levels in CNE-2 and CNE-2S were both increased after 1 μmol·L-1cisplatin treatment but there is no significant difference in levels of glutathione between these two cell lines.After treated with cisplatin，SOD level were increased in both CNE-2S and CNE-2，but it is higher in CNE-2S than that in CNE-2（P＜0.05）.The mRNA levels of GSS，GCLC，GCLM，and SOD1 were not different significantly between in CNE-2 and in CNE-2S with or without cisplatin treatment.However，SOD2 in CNE-2S were higher than that in CNE-2 on both mRNA and protein levels（P＜0.05）.Silenced SOD2 disrupted the resistance of cisplatin in CNE-2S.Conclusion These data suggest that NPC stem cells（CNE-2S）enhance its drug resistance to cisplatin through highly expression of SOD2 which posed anti-ROS capacity.

nasopharyngeal carcinoma；cancer stem cells；Cisplatin；drug resistance；reactive oxygen；glutathione；superoxide dismutase；RNA interference

R739.6

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.001

国家自然科学基金资助项目（81272434）；湛江市科技攻关计划（2013B01091）；广东医学院青年基金（Q2012005）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201310571004）；广东省大学生创新创业训练计划项目（1057113030）；广东医学院大学生创新实验项目立项（ZZDM012，ZZDM013）

1广东医学院生物化学与分子生物学教研室（邮编523808）；2东莞市人民医院；3广东医学院药剂学教研室；4广东医学院招投标中心；5广东省医学分子诊断重点实验室

林碧华（1982），女，硕士，主要从事中药小分子抗肿瘤机制研究

△E-mail:kyz009@126.com