丹皮酚对急性心肌梗死后心室重构模型大鼠RAS的影响

顾媛媛，周晓慧，徐倩，赵静怡

实验研究

丹皮酚对急性心肌梗死后心室重构模型大鼠RAS的影响

顾媛媛，周晓慧△，徐倩，赵静怡

目的 观察丹皮酚对急性心肌梗死（AMI）后心室重构模型大鼠肾素-血管紧张素系统（RAS）的影响。方法 对健康雄性SD大鼠进行左冠状动脉前降支结扎，复制AMI模型。设假手术组、模型组、卡托普利组、丹皮酚低剂量（6 mg/kg）组、丹皮酚中剂量（9 mg/kg）组和丹皮酚高剂量（12 mg/kg）组。造模成功并存活下来的大鼠，分别给予各组不同药物处理。用药4周后取材，采用HE染色法观察心肌组织病理变化；采用实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）检测各组心肌组织中血管紧张素原（AGT）、血管紧张素Ⅱ受体（AGTR）1和内皮缩血管肽1（ET）-1 mRNA水平表达情况并进行分析；采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测各组大鼠心肌组织中肽基二肽酶A（ACE），血管紧张素Ⅱ（Ang）-Ⅱ和AGTR1的蛋白表达水平。结果 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中AGT、AGTR1、ET-1 的mRNA表达明显升高，Ang-Ⅱ、ACE、AGTR1的蛋白表达亦显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，其在丹皮酚高剂量组和卡托普利组心肌组织中mRNA表达以及蛋白表达均显著降低（P＜0.05）。丹皮酚对降低其mRNA表达和蛋白表达存在明显的剂量依赖性。结论 丹皮酚能够延缓大鼠AMI后心室重构，其机制可能与抑制RAS的过度激活有关。

心肌梗死；心室重构；肾素-血管紧张素系统；血管紧张素原；血管紧张素Ⅱ受体1；内皮缩血管肽1；肽基二肽酶A；血管紧张素Ⅱ；丹皮酚

心肌梗死过程中，由于心室长时间受压力负荷、容量负荷及心肌损伤刺激，可导致心室发生病理改变［1］，即心室重构。心室重构的发生发展过程复杂，越来越多的学者认为，由于活性氧增多导致氧化应激反应的发生和局部产生的血管紧张素（Ang）-Ⅱ在心肌梗死后的心室重构中起到了重要的作用［2］，Ang-Ⅱ是肾素-血管紧张素系统（RAS）关键因子。RAS的激活在包括急性心肌梗死（AMI）在内的心血管疾病中发挥着重要作用［3］。丹皮酚药理活性广泛，前期研究证实，丹皮酚可以通过减轻炎症反应抑制AMI后心室重构［4］。关于丹皮酚能否通过抑制RAS的激活改善AMI后心室重构作用鲜见报道。本研究旨在探讨丹皮酚对AMI后心室重构模型大鼠RAS的影响，为丹皮酚抗心肌梗死后心室重构的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 丹皮酚注射液购自宁波天真制药有限公司；卡托普利片购自北京亚宝生物药业有限公司；注射用青霉素钠购自华北制药股份有限公司；Trizol购自invitrogen公司；Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）购自大连宝生物工程有限公司；兔抗鼠GAPDH一抗购自Epitomics公司；兔抗鼠血管紧张素Ⅱ受体1（AGTR1）一抗购自Affinity公司；兔抗鼠肽基二肽酶A（ACE）一抗购自Abcam公司；兔抗鼠Ang-Ⅱ一抗购自EterLife公司；二抗（山羊抗兔IgG/辣根酶标记）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECG-11D心电图机购自惠州科美思医用仪器有限公司；DW3000-B型小动物人工呼吸机购自淮北正华生物科技有限公司；高速冷冻离心机购自Sigma公司；实时荧光定量（Real-Time）PCR仪Mx3000P购自美国安捷伦Stratagene公司；DYY-8c型转移电泳仪购自北京市六一仪器厂。

1.2 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠60只，体质量（250±20）g，购自北京华阜康生物技术有限公司。适应性饲养1周，将大鼠按体质量编号，采用随机区组方法，将实验大鼠分为6组，分别为假手术组、模型组、丹皮酚低、中、高剂量组和卡托普利组。

1.3 AMI模型的制备 给大鼠腹腔注射8%水合氯醛，待大鼠完全麻醉后，打开气管插入呼吸机，于大鼠左三、四肋间开胸暴露心脏，在其心耳下缘2 mm左右处找到其左冠状动脉前降支并进行结扎（假手术组只穿线不结扎）。结扎完成后逐层、快速地缝合肌肉和皮肤。观察心电图，以ST段明显抬高作为判断AMI模型成功的标准。给术后成活的大鼠注射青霉素钠3 d后，再次进行心电图检查，若仍然存在ST段抬高，则模型建立成功。给予各组造模成功并存活下来的大鼠相应药物处理，分别为丹皮酚组（低6 mg/kg、中9 mg/kg、高12 mg/kg）、卡托普利组（10 mg/kg），模型组和假手术组以等量生理盐水灌胃。各组大鼠给药时间均为4周。4周后取材，一部分组织进行固定，用于HE染色；一部分放入液氮中冷冻，继而放入-80℃冰箱保存，用于Real-Time PCR和Western blot实验。

1.4 心肌组织病理变化观察 在结扎线以下切取3～5 mm心肌组织，于4%多聚甲醛内固定。24 h后，采用常规石蜡包埋，5 μm连续切片，HE染色观察心肌组织的病理变化。

1.5 Real-Time PCR检测各组心肌组织中AGT、AGTR1、ET-1表达 引物由大连宝生物公司设计合成。β-actin引物：上游5′-GGAGATTACTGGCCCTGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′；AGT引物：上游5′-GCTTGTCTGGGCTGGAGCTAA-3′，下游5′-GACCCAGGTCAGGATGCAGAA-3′；AGTR1引物：上游5′-GATTCGTGGCTTGAGTCCTGT-3′，下游5′-TCTGGGAGGGTTGTGTGATTT-3′；ET-1引物：上游5′-ACATTCCAAGAGAGGTTGAGGTG-3′，下游5′-AGACAGCAAGAAGAGGCAAGAGA-3′。按照Trizol核酸提取试剂要求提取各组总RNA，检测总RNA的纯度和浓度，纯度在1.8～2.0左右为好。按照Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒说明书进行逆转录反应合成cDNA后进行Real-time PCR检测，扩增条件为95℃预变性30 s，95℃5 s、55℃30 s，扩增40个循环，在55℃读取荧光，每个指标检测3次，取平均值。每个反应孔内荧光信号达到设定阈值时所对应的循环次数即Ct值，目的基因Ct值与内参基因Ct值进行标准化处理，依据 2-ΔΔCt法［5］对目的基因表达进行相对定量分析。ΔΔCt=（待测组目的基因Ct均值-待测组内参照基因Ct均值）-（对照组目的基因Ct均值-对照组内参照基因Ct均值）［6］。

1.6 Western blot检测各组心肌组织中ACE、Ang-Ⅱ、AGTR1蛋白表达 取50 mg大鼠梗死区心肌组织，剪碎，放入RIPA裂解液中，冰上匀浆，离心取上清。按BCA法蛋白定量试剂盒说明书测量各组样品总蛋白浓度。将蛋白样品与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液按1∶4比例混合均匀，95℃水浴10 min使蛋白变性，分装并保存在-80℃冰箱内。根据目的蛋白分子质量配胶，取蛋白样品上样电泳，转膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗室温摇床上孵育3 h，二抗室温摇床孵育1 h，TBST洗涤。ECL试剂作用，置于暗室曝光、显影，使用Quantity One软件分析显影条带，以目的蛋白与GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）形式表示，若数据符合正态分布并且方差齐，采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果 假手术组心肌细胞规则排列，细胞核清晰可见；模型组心肌细胞有肥大、坏死现象，排列紊乱，细胞核有固缩或消失现象；与模型组比较，丹皮酚低、中、高剂量组和卡托普利组心肌组织病理变化均有不同程度的减轻，其中丹皮酚高剂量组和卡托普利组改善最为明显，见图1。

Fig.1 Observation of myocardial tissue under optical microscope in six groups of rats（HE，×200）图1 各组大鼠心肌组织光镜观察（HE，×200）

2.2 Real-Time PCR检测结果 与假手术组比较，模型组心肌组织AGT、AGTR1和ET-1 mRNA表达均显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，丹皮酚高剂量组和卡托普利组心肌组织3种mRNA表达显著降低（P＜0.05）；丹皮酚中剂量组心肌组织AGT和AGTR1 mRNA表达亦显著降低（P＜0.05），ET-1 mRNA表达无明显变化，差异无统计学意义；丹皮酚低剂量组心肌组织AGT mRNA表达显著降低（P＜0.05），AGTR1和ET-1 mRNA表达无明显变化，差异无统计学意义，见表1。

Tab.1Comparison of AGT，AGTR1 and ET-1 mRNA expression in myocardial tissue between six groups表1 各组心肌组织中AGT、AGTR1和ET-1mRNA表达的比较 （n=3，2-ΔΔCt，±s）

Tab.1Comparison of AGT，AGTR1 and ET-1 mRNA expression in myocardial tissue between six groups表1 各组心肌组织中AGT、AGTR1和ET-1mRNA表达的比较 （n=3，2-ΔΔCt，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与模型组比较，P＜0.05，表2同

组别假手术组模型组丹皮酚低剂量组丹皮酚中剂量组丹皮酚高剂量组卡托普利组F AGT 1.00±0.00 192.67±31.96a23.35±0.80b5.41±1.54b2.10±0.95b0.97±0.32b68.406＊＊AGTR1 1.00±0.00 2.07±0.30a1.70±0.52a1.19±0.32b0.82±0.03b0.92±0.67b4.825＊ET-1 1.00±0.00 1.95±0.20a1.31±0.22 1.44±0.74 0.74±0.62b0.75±0.25b3.588＊

2.3 Western blot检测结果 与假手术组比较，模型组心肌组织中ACE、Ang-Ⅱ和AGTR1的蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，除丹皮酚低剂量组中AGTR1蛋白表达无明显变化外，其余各组3种蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）；见图2～4，表2。

Fig.2 ACE protein expression in myocardial tissue of six groups图2 各组大鼠心肌组织ACE蛋白表达情况

Fig.3 Ang-Ⅱprotein expression in myocardial tissue of six groups图3 各组大鼠心肌组织Ang-Ⅱ蛋白表达情况

Fig.4 AGTR1 protein expression in myocardial tissue of six groups图4 各组大鼠心肌组织AGTR1蛋白表达情况

3 讨论

心肌梗死后，由于心肌缺血、缺氧导致心脏排出量下降，交感神经兴奋，加上肾脏血管收缩、血流量下降，导致肾灌注量及灌注压下降，肾小球旁器细胞分泌并释放的肾素增加，RAS被激活［7］，AGT在肾素作用下产生不具生物活性的血管紧张素Ⅰ，经ACE作用产生Ang-Ⅱ。Ang-Ⅱ具有强大的收缩血管功能，Ang-Ⅱ的增多可促使ET-1分泌增多。ET-1能使血管阻力升高、血管平滑肌增殖，同时ET-1也具有激活RAS的作用，最终导致心肌细胞肥大和成纤维细胞增生，直接促进心室重构。另外，Ang-Ⅱ也能通过内分泌或旁分泌的方式与AGTR1作用，导致血管收缩、心肌细胞生长、成纤维细胞增殖，促使心室肥大和纤维化，加速心室重构，最终导致心力衰竭。

Tab.2 Comparison of ACE，Ang-Ⅱand AGTR1 protein expression in myocardial tissue between six groups表2 各组心肌组织中ACE、Ang-Ⅱ和AGTR1蛋白相对表达量的比较 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of ACE，Ang-Ⅱand AGTR1 protein expression in myocardial tissue between six groups表2 各组心肌组织中ACE、Ang-Ⅱ和AGTR1蛋白相对表达量的比较 （n=3，±s）

组别ACE/GAPDHAng-Ⅱ/GAPDHAGTR1/GAPDH假手术组0.034±0.0040.029±0.0020.023±0.002模型组1.006±0.012a0.800±0.020a0.956±0.016a丹皮酚低剂量组0.974±0.031b0.764±0.038b0.976±0.027丹皮酚中剂量组0.655±0.006b0.616±0.012b0.855±0.025b丹皮酚高剂量组0.505±0.176b0.263±0.006b0.633±0.045b卡托普利组0.434±0.013b0.221±0.301b0.141±0.136bF 1 464.235＊＊838.659＊＊828.815＊＊

课题组前期研究显示，丹皮酚可使血流动力学指标左心室收缩压（LVSP）及左心室内压最大上升速率与最大下降速率（±dP/dtmax）升高，左心室舒张压（LVEDP）降低，大鼠心肌纤维化程度明显减轻，证实丹皮酚能够改善大鼠心肌梗死后的心室重构［8］。本研究HE染色显示，大鼠AMI后心肌组织细胞出现明显的肥大、坏死现象；丹皮酚药物干预4周后，心肌病理组织形态变化得到不同程度的恢复，表明丹皮酚对大鼠心肌梗死后心室重构有一定的改善作用。心肌梗死后大鼠心肌组织中AGT、AGTR1、ET-1 mRNA水平表达均明显升高；ACE、Ang-Ⅱ、AGTR1的蛋白表达亦显著升高。丹皮酚药物干预4周后，与模型组比较，大鼠心肌组织中AGT、AGTR1、 ET-1 mRNA水平表达均显著降低；ACE、Ang-Ⅱ、AGTR1的蛋白表达亦显著下降，并且存在明显的剂量依赖性。提示丹皮酚能够抑制心梗后心室重构大鼠心肌组织AGT、AGTR1、ET-1 mRNA水平，以及ACE、Ang-Ⅱ、AGTR1蛋白水平的表达。

综上，丹皮酚能够抑制AGT、ACE的表达而降低Ang-Ⅱ的水平，进而使ET-1表达下调；同时丹皮酚还将抑制AGTR1的表达，减少Ang-Ⅱ与AGTR1的结合。因而推断，丹皮酚逆转心肌梗死后大鼠的心室重构可能是从多个环节阻断RAS作用的，然而其具体分子机制尚不十分明确，有待于深入研究。

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（2014-08-29收稿 2015-01-12修回）

（本文编辑 李国琪）

Effects of paeonol on RAS occurred on the development of ventricular remodeling after acute myocardial infarction in rats

GU Yuanyuan，ZHOU Xiaohui△，XU Qian，ZHAO Jingyi
Chengde Medical College，Chengde 067000，China
△Corresponding Author E-mail:zxh5055@sina.com

Objective To investigate the effects of paeonol on renin-angiotensin system（RAS）occurred on the development of ventricular remodeling after acute myocardial infarction（AMI）in rats.Methods The left anterior descending coronary artery was ligated to establish the model of AMI in male SD rats.Six groups were set up:sham-operation group，AMI model group，captopril control group，paeonol low dose group（6 mg/kg），paeonol middle dose group（9 mg/kg）and paeonol high dose group（12 mg/kg）.Rats were given treatment for 4 weeks after the AMI model was established.HE staining was used to observe changes of myocardial tissue.Real-time PCR was used to detect the mRNA levels of angiotensinogen（AGT），angiotensinⅡreceptor type1（AGTR1）and endothelin（ET）-1 of six groups.Western blot assay was used to detect the protein levels of peptidyl-dipeptidase A（ACE），angiotensinⅡ（Ang）-Ⅱand AGTR1 in six groups.Results The transcription of AGT，AGTR1，ET-1mRNA and the expressions of ACE，Ang-Ⅱand AGTR1protein were significantly higher in myocardial tissue of AMI rats than those of sham-operation rats（P＜0.05）.Compared with model group，the expressions of AGT，AGTR1，ET-1mRNA and ACE，Ang-Ⅱ，AGTR1 protein were significantly decreased in paeonol high dose group and captopril control group（P＜0.05）.Paeonol reduced the expressions of those mRNA and protein levels in a significant dose dependent manner.Conclusion Paeonol can slow down the deterioration of the ventricular remodeling after AMI in rats，which may be related to the inhibition of over-activation of RAS.

myocardial infarction；ventricular remodeling；renin-angiotensin system；angiotensinogen；angiotensinⅡreceptor type1；endothelin-1；peptidyl-dipeptidase A；angiotensinⅡ；paeonol

R541

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.006

河北省自然科学基金资助项目（C2011406009）；河北省医学科学研究重点课题计划（20100137）

承德医学院中药研究所（邮编067000）

顾媛媛（1989），女，硕士研究生，主要从事分子药理研究

△E-mail:zxh5055@sina.com