三伏咳喘膏治疗支气管哮喘的实验研究

熊湘明

三伏咳喘膏治疗支气管哮喘的实验研究

熊湘明

目的 观察三伏咳喘膏贴敷治疗对哮喘豚鼠白细胞介素-18（IL-18）、嗜酸性粒细胞（EOS）及肺组织病理的影响，并探讨其作用机制。方法 将60只豚鼠随机分为对照组、模型组、治疗1组（穴位贴药1 h），治疗2组（穴位贴药3 h），治疗3组（穴位贴药6 h），治疗4组（注射地塞米松），每组10只。对照组腹腔注射生理盐水1 mL，其余组均腹腔注射10%的鸡卵清白蛋白1 mL致敏，饲养14 d后，于第15天起将对照组之外的所有豚鼠置于4 L密闭玻璃罐中，用1%的鸡卵清白蛋白生理盐水对豚鼠雾化吸入，30～60 s/次，1次/d，连续1周。模型建立后第2天，对照组及模型组于肺腧、心腧、膈腧处涂抹生理盐水，纱布包扎固定；治疗1～3组，于同样穴位贴敷三伏咳喘膏（5 mm×5 mm×1 mm），3组分别贴治1 h、3 h、6 h；治疗4组于腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液，相应穴位处涂抹生理盐水固定；各组均是每天贴敷1次，6 h/次，共7 d。结果 与模型组比较，咳喘膏穴位贴敷各组血IL-18、EOS水平明显下降，病理学改变明显减轻，穴位贴药3 h组效果最好。结论 咳喘膏穴位贴敷对哮喘豚鼠血IL-18、EOS有明确影响，可减轻哮喘豚鼠模型气道炎性损伤。

三伏咳喘膏；穴位贴敷；白细胞介素18；嗜酸性粒细胞；哮喘；豚鼠

支气管哮喘是由多种细胞和细胞成分参与的气道慢性炎症反应性疾病，常引起气道反应性增高，具有反复发作的特点。穴位贴敷治疗支气管哮喘临床效果显著，但其实验研究开展较少，药物组成、贴治时间、贴治方案等尚不规范，缺少系统的基础研究［1］。本课题从动物实验角度研究三伏咳喘膏贴敷对哮喘豚鼠白细胞介素-18（IL-18）、嗜酸性粒细胞（EOS）及肺组织病理的影响，为今后运用此法治疗支气管哮喘等呼吸系统疾病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 超声雾化器（北京亚都空气净化技术有限公司，型号：YC-D203），生物组织显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：BX-41），酶标仪（美国BIO-RAD公司，型号：mod-el-680），血细胞分析仪/细胞计数器（日本NIHON KOHDEN公司，型号：L180045）。

1.1.2 试剂 三伏咳喘膏由天津市公安医院制剂室提供（批号：TJZB-Z2007010278），主要成分；白芥子、甘遂、芫花、细辛、牡荆叶、麻黄、沉香、百合、生姜等。鸡卵清白蛋白购自美国Sigma公司；IL-18酶联免疫吸附测定试剂盒购自美国RB公司。

1.1.3 动物 清洁级健康雄性豚鼠60只，平均体质量（300± 50）g，购自中国医学科学院放射医学研究所动物中心。采用随机数字表法随机分为6组：对照组，模型组，治疗1组（穴位贴药1 h），治疗2组（穴位贴药3 h），治疗3组（穴位贴药6 h），治疗4组（注射地塞米松），每组10只。

1.2 方法

1.2.1 建立哮喘模型 均自然喂养，对照组腹腔注射生理盐水1 mL，其余组均腹腔注射10%的鸡卵清白蛋白1 mL致敏，饲养14 d后，于第15天起将对照组之外的所有豚鼠分别置于4 L密闭玻璃罐中，用1%的鸡卵清白蛋白生理盐水对豚鼠雾化吸入，30～60 s/次，1次/d，连续1周，至豚鼠出现烦躁、呛咳、呼吸深快、点头运动为模型建立成功［2］。

1.2.2 实验方法 建立模型后第2天，在相当于人体督脉和膀胱经处备皮。对照组及模型组于肺腧、心腧、膈腧处［3］涂抹生理盐水，纱布包扎固定；治疗1～3组，于同样穴位贴敷三伏咳喘膏（5 mm×5 mm×1 mm），3组分别贴治1 h、3 h、6 h；治疗4组于腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液，相应穴位处涂抹生理盐水固定；各组均是每天贴敷1次，6 h/次，共7 d。治疗结束24 h内股动脉放血处死，收集血液，4 000 r/min离心10 min，分离血清，采用酶联免疫法测定IL-18（操作按试剂说明进行），血细胞分析仪测定EOS。解剖取肺脏，用4%甲醛溶液浸泡固定，切3 μm薄片，石蜡包埋，HE染色，光镜观察。

1.3 统计学方法 测定结果以x±s表示，运用SPSS 11.0统计软件进行分析，各组比较采用方差分析，组间多重比较用LSD-t，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-18检测结果 治疗1组、治疗3组、治疗4组、模型组的IL-18均高于对照组，治疗1～4组的IL-18水平低于模型组（P＜0.05）；4个治疗组之间IL-18比较，治疗2组IL-18水平最低（P＜0.05），见表1。

2.2 EOS检测结果 模型组EOS明显高于对照组，治疗1、2、4组的EOS水平均低于模型组（均P＜0.05）；治疗组之间EOS比较，差异无统计学意义，见表1。

2.3 肺组织病理检测结果 对照组肺泡大小均匀一致，未见肺泡扩张；肺泡腔内未见炎性细胞浸润；细支气管黏膜上皮排列整齐，腔内无黏液积聚，见图1。模型组细支气管黏膜上皮排列紊乱，增生明显；黏膜上皮、基底膜增厚；黏膜下层可见多量单核细胞和嗜酸性粒细胞浸润；细支气管腔内有黏液积聚，见图2。治疗1组黏膜上皮增生、基底膜增厚程度较模型组明显减轻；黏膜下层可见少量单核细胞和嗜酸性粒细胞浸润，细支气管腔内无黏液积聚，见图3。治疗2组细支气管黏膜上皮排列紊乱，增生明显；黏膜上皮、基底膜增厚；黏膜下层未见单核细胞和嗜酸性粒细胞浸润，细支气管腔内无黏液积聚，见图4。治疗3组黏膜上皮增生、基底膜增厚程度较模型组明显减轻；黏膜下层可见中量单核细胞和嗜酸性粒细胞浸润；细支气管腔内少量黏液积聚，病变较模型组轻，见图5。治疗4组黏膜上皮增生、基底膜增厚程度较模型组明显减轻；黏膜下层可见少量单核细胞和嗜酸性粒细胞浸润，细支气管腔内无黏液积聚，见图6。

Tab.1 Comparison of IL-18 and EOS levels between six group表1 各组IL-18、EOS水平比较 （n=10，x±s）

3 讨论

3.1 穴位贴敷治疗哮喘 穴位贴敷属中医外治法，秦汉时期就有哮喘外治法的记载，不同历史时期均有发展。我院三伏咳喘膏是《张氏医通》白芥子涂法的继承与发展，中药选取白芥子、沉香、细辛等，贴敷于肺腧、心腧、膈腧等穴。通过刺激穴位，疏通经络、调理气血阴阳，能有效治疗与预防支气管哮喘，所取中药具有发散、走窜的性质，能迅速透过皮肤，发挥其药理作用［4-5］。

3.2 三伏咳喘膏对哮喘豚鼠IL-18的影响 IL-18能诱导细胞产生多种细胞因子，增强Th1细胞活性，在支气管哮喘发病及气道炎症中起重要作用，与速发型变态反应及EOS增多症等疾病密切相关［6-7］。IL-18能直接刺激肥大细胞释放组胺，增加EOS的水平，通过募集EOS和刺激IgE的产生来引发过敏性炎症及气道高反应［8］。本研究结果显示，模型组IL-18水平明显升高，证明其在支气管哮喘发作气道炎症反应中起重要作用，在炎症介质中有特殊的诱导方式。穴位贴敷治疗各组的IL-18水平均低于模型组，提示三伏咳喘膏穴位贴敷可降低IL-18水平，减轻Th2型免疫应答，间接抑制肥大细胞释放组胺，减轻EOS浸润，抑制气道高反应，从而减轻气道的炎症程度。进一步分析发现，穴位贴药3 h组的IL-18水平低于穴位贴药1 h组和6 h组，且6 h组可见炎性细胞浸润及明显的病理损伤，说明贴治效果不随贴治时间的延长而提高，穴位贴药3 h效果最好。

3.3 三伏咳喘膏贴敷对哮喘豚鼠EOS的影响 EOS是哮喘气道炎症的关键效应细胞，在气道慢性结构改变中起主要作用，与气道高反应、气道上皮细胞损伤高度相关［9-10］。哮喘发作状态下，气道里有大量嗜EOS浸润，EOS参与哮喘的发病，在变应原刺激后，外周血、支气管黏膜和支气管肺泡灌洗液（BALF液）中可检测到大量EOS，其水平可作为了解支气管哮喘发病机制和预后的一项重要指标［11］。本研究结果显示，模型组EOS水平明显升高，穴位贴药1 h、3 h组及地塞米松组EOS均低于模型组，提示三伏咳喘膏穴位贴敷能降低哮喘豚鼠EOS水平，减轻气道炎症反应。

（图1～6见插页）

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（2014-10-10收稿 2014-12-30修回）

（本文编辑 闫娟）

Study of sanfukechuangao acupoint application for treatment of asthma in guinea pigs

XIONG Xiangming
Gongan Hospital of Tianjin，Tianjin 300211，China

Objective To observe the effect of sanfukechuangao acupoint application on changes of interleukin-18 （IL-18），eosinophils（EOS）and pulmonary pathology in asthma model of guinea pigs，and its underlying mechanism thereof.Methods A total of 60 guinea pigs were randomized into normal control group，asthma model group，acupoint-application 1 h group，acupoint-application 3 h group，acupoint-application 6 h group and dexamethasone group.Asthma model was established by intraperitoneal injection of 10%ovalbumin（OVA，1 mL）and forced inhalation of atomized 2%OVA.Skin preparation and external application of Chinese medicinal herbs were made on back of guinea pigs，and"Feishu"，"Xinshu"，"Geshu"were selected in acupuncture points）.Levels of IL-18 and EOS were detected by immunohistochemisty method.Results Compared with model group，the levels of IL-18 and EOS were significantly decreased，the pathological changes were significantly reduced in three acupoint-application groups.The effectiveness of acupoint-application 3 h group was the best in three groups.Conclusion Sanfukechuangao acupoint application can influence the levels of IL-18 and EOS effectively，and relieve phlegmonosis injuries in pulmonary tissue of asthma model of guinea pig.

sanfukechuangao；acupoint application；interleukin-18；eosnophils；asthma；guinea pigs

R242

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.008

天津市公安局科研项目（2008023）

天津市公安医院（邮编300211）

熊湘明（1971），男，副主任医师，医学硕士，主要从事中西医结合呼吸系统疾病研究