GLP-1通过SDF-1/CXCR4信号通路调控人脐血内皮祖细胞增殖、分化和凋亡

刘峰，许文琼，闵娜，汤佳珍，黄海华

GLP-1通过SDF-1/CXCR4信号通路调控人脐血内皮祖细胞增殖、分化和凋亡

刘峰1，许文琼1，闵娜2，汤佳珍1，黄海华1

目的 探讨胰高血糖素样肽1（GLP-1）调控人脐血内皮祖细胞（EPCs）增殖、分化与凋亡的分子机制。方法 从健康孕妇脐带血分离和培养EPCs，以2×105密度接种于6孔细胞板，分别转染空载体质粒（对照组）、pcDNA3-GLP-1质粒（GLP-1组）、pcDNA3-GLP-1质粒+AMD3100（GLP-1+AMD3100组）及单纯AMD3100（AMD3100组）。将pcDNA3-GLP-1质粒转染EPCs，以25 μmol/L AMD3100阻断体外培养的EPCs的基质细胞衍生因子（SDF-1）/趋化因子受体4（CXCR4）信号通路1 h。采用RT-PCR检测分化和凋亡相关基因PPARγ、C/EBPα与Caspase-3基因表达，MTT比色法检测细胞增殖能力，Caspase-3活性检测试剂盒测定Caspase-3活性。结果 与对照组相比，GLP-1过表达显著提高了C/EBPα及PPARγ mRNA表达，促进了EPCs细胞增殖，降低了Caspase-3 mRNA表达和Caspase-3活性（均P＜0.05）。当SDF-1/CXCR4信号通路被阻断后，GLP-1对C/EBPα及PPARγ mRNA表达、EPCs细胞增殖的促进作用，以及对Caspase-3 mRNA表达和Caspase-3活性的抑制作用均明显减弱（均P＜0.05）。结论 GLP-1可通过调节SDF-1/CXCR4信号通路促进EPCs增殖与分化，抑制其凋亡。

胰高血糖素样肽1；胎血；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；细胞增殖；细胞分化；细胞凋亡；内皮祖细胞；SDF-1/CXCR4；信号通路

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）主要来源于骨髓和外周血，在体外可诱导分化各种内皮细胞特异性抗原，在体内则能分化成有功能的内皮细胞［1］。目前，应用EPCs修复损伤血管已经成为研究热点之一。有研究报道，胰高血糖素样肽1 （glucagon like peptide 1，GLP-1）是一种促胰岛素肽，具备多种生理功能，包括促进胰岛β细胞增殖和分化、抑制食欲、增强记忆及改善心血管内皮细胞功能［2-3］。另有研究指出，基质细胞衍生因子（stromal cell derived factor，SDF-1）/趋化因子受体4（chemokinereceptor 4，CXCR4）可调节机体的炎症与免疫反应，抵抗人类免疫缺陷病毒（HIV）感染，抑制肿瘤细胞迁移，保护胚胎发育，参与血管新生等［4-6］。本课题组前期研究证实，GLP-1可调控SDF-1与CXCR4 mRNA和蛋白表达［7］，由此推测GLP-1具有促EPCs增殖、移行与分化作用，且该机制可能与SDF-1/CXCR4通路有关。GLP-1是否通过调控SDF-1/CXCR4轴信号通路影响EPCs生物学效应尚少见研究。本研究采用阻断剂AMD3100阻断SDF-1/CXCR4信号通路后，研究GLP-1对EPCs的增殖、分化及凋亡的影响，探讨GLP-1调控的信号转导机制，以期为血管并发症的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞分离与培养 EPCs的分离和鉴定参照文献［7］。无菌条件下，采用含肝素的注射器抽取健康孕妇脐带血约20 mL。采用密度梯度离心法分离单个核细胞，并将其接种于24孔培养板，加入M199培养基，培养基含10%胎牛血清、1%链霉素、1%青霉素和 50 μg/L血管内皮生长因子（VEGF），置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2 主要试剂 CXCR4阻断剂AMD3100购自AbMole公司，转染试剂lipo2000购自英韦创津公司。实时定量PCR所用SYBR Green PCR Master Mix购自美国应用生物公司。β-actin（ab8229）、CXCR4抗体（ab2074）均购自Abcam公司，pcDNA3-GLP-1质粒由本实验室构建，构建步骤参照文献［6］。

1.3 实验分组与处理 将体外培养的EPCs以2×105密度接种6孔细胞板。每组6个重复，每个重复6个复孔。分别转染空载体质粒（对照组）、pcDNA3-GLP-1质粒（GLP-1组）、pcDNA3-GLP-1质粒+AMD3100（GLP-1+AMD3100组）及单纯AMD3100（AMD3100组）。

1.4 Western Blot 将ECPs以2×105个/mL接种于6孔板，当细胞融合达65%时，加入0、5、15与25 μmol/L AMD3100阻断剂，48 h后收集细胞并提取蛋白。经过电泳、转膜后，取下硝酸纤维膜，脱脂牛奶封闭1 h后，用内参兔抗人β-actin一抗（ab8229）（1∶500）、兔抗人CXCR4一抗（ab2074，1∶500）孵育过夜，鼠抗兔二抗孵育1 h后显色，进行化学发光反应并显影、定影。将图片扫描后，用Image J图像分析软件进行蛋白灰度分析。

1.5 实时定量PCR 将GLP-1过表达细胞后，采用AMD3100阻断剂作用细胞24、48、96 h后行异硫氰酸胍/苯酚-氯仿萃取法，按照Trizol试剂盒说明从6孔板中提取总RNA（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。根据使用手册，用ABI PRISM 7500荧光定量 PCR仪（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）检测PPARγ、C/EBPα与Caspase-3基因表达。PCR反应体系50℃2 min和95℃10 min，1个循环，以及95℃15 s，60℃15 s和72℃30 s，共40个循环。β-actin作为内参。特异性引物序列由上海博尚生物技术公司合成，引物序列见表1。

Tab.1 Primer sequences表1 引物序列

1.6 MTT比色法 采用MTT比色法检测GLP-1对SDF-1/ CXCR4信号通路阻断后细胞增殖能力的影响。将ECPs转染质粒后以1×104个/mL接种于96孔板，融合度达55%时，以25 μmol/L AMD3100作用细胞1 h。培养24、48、96 h后，向每孔中加入50 μL 2 g/L MTT溶液，再在培养箱继续培养3 h。1 500 r/min离心5 min后移除细胞上清，每孔中加入150 μL DMSO。室温下将细胞板置于振荡器低速振荡20 min，并于波长490 nm处测定其光密度（OD）值。

1.7 Caspase-3活性检测 采用Caspase-3检测试剂盒（Beyotime）检测Caspase-3活性。将ECPs转染质粒后以1×106个/mL接种于6孔板，当细胞融合达65%时加入25 μmol/L AMD3100作用1 h，培养24、48、96 h后收集细胞。PBS洗涤，采用蛋白裂解液分离细胞中的蛋白，并放置冰上待用。吸取50 μL细胞蛋白，加入50 μL反应缓冲液及加Ac-DEVD-AMC（Caspase-3四肽荧光底物）5 μL，于37℃避光孵育4 h。于405 nm波长处，用酶标仪测定其OD值。通过计算OD阻断剂/OD阴性对照的倍数来确定凋亡诱导剂组Caspase-3活化程度。

1.8 统计学方法 数据采用SPSS 17.0软件进行统计处理，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，并行邓肯氏多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阻断效果分析 与对照组（0.465±0.085）相比，不同剂量AMD3100作用后，CXCR4蛋白表达明显降低，25 μmol/L AMD3100组（0.054±0.023）作用最为明显（F=16.347，P＜0.05），见图1。证明25 μmol/L AMD3100阻断效果最佳，可用于后续阻断实验。

Fig.1 Effects of AMD3100 inhibitor on CXCR4 protein expression图1 AMD3100阻断剂对CXCR4蛋白表达的影响

2.2 GLP-1对SDF-1/CXCR4信号通路阻断后细胞分化的影响 与对照组相比，GLP-1过表达显著提高了C/EBPα及PPARγ mRNA表达（P＜0.05），且具时间依赖性。当SDF-1/CXCR4信号通路被阻断后，GLP-1对C/EBPα及PPARγ mRNA表达均明显抑制（P＜0.05），见图2。

Fig.2 Effects of GLP-1 on cell differentiation after the block of SDF-1/CXCR4 signaling pathway图2 GLP-1对SDF-1/CXCR4信号通路阻断后细胞分化的影响

2.3 GLP-1对SDF-1/CXCR4信号通路阻断后细胞增殖的影响 与对照组相比，GLP-1过表达则明显促进了细胞增殖（P＜0.05）。AMD3100阻断剂阻断SDF-1/CXCR4信号通路后，GLP-1对EPCs的增殖作用明显降低（P＜0.05），见图3。

Fig.3 Effects of GLP-1 on cell proliferation after the block of SDF-1/CXCR4 signaling pathway图3 GLP-1对SDF-1/CXCR4信号通路阻断后细胞增殖的影响

2.4 GLP-1对SDF-1/CXCR4信号通路阻断后细胞凋亡的影响 与对照组相比，GLP-1过表达降低了Caspase-3 mRNA表达和Caspase-3活性，其均在GLP-1作用48 h后明显降低，96 h时细胞表现出的下调趋势最为显著（P＜0.05）。当SDF-1/CXCR4信号通路被阻断后，GLP-1对Caspase-3 mRNA表达和Caspase-3活性的抑制作用均明显减弱（P＜0.05）。见图4。

Fig.4 Effects of GLP-1 on cell apoptosis after block of SDF-1/CXCR4 signaling pathway图4 GLP-1对SDF-1/CXCR4信号通路阻断后细胞凋亡的影响

3 讨论

GLP-1是由肠道L细胞分泌的一种多肽，其分泌受葡萄糖、脂肪等营养物质的调控［8-9］。有报道指出，GLP-1在改善心血管内皮细胞功能方面发挥重要作用［3］。EPCs是一种重要的促进血管新生的细胞，目前以EPCs为基础的心血管疾病治疗被广泛关注［10］。目前，有关GLP-1在体外培养的EPCs中的调控机制尚少见报道。本文对GLP-1过表达后EPCs的生物学效应进行研究，发现GLP-1可通过SDF-1/ CXCR4信号通路调控EPCs的增殖、分化与凋亡。

对GLP-1功能的研究表明，GLP-1不但可以促使前胰岛细胞向β细胞表型分化，而且可以增强胰岛β细胞的增殖和存活［11］。此外，GLP-1还可以保护小鼠胰岛β细胞免受过氧化氢诱导的凋亡，及阻止谷氨酸盐诱导的大鼠海马神经元细胞和成纤维细胞凋亡［12-13］。进一步研究证实，GLP-1抑制β细胞与心肌细胞调亡的途径与PI3K/AKT信号途径密切相关［11］。PPARγ与C/EBPα在细胞分化过程中发挥重要作用［14］。Caspase-3是Caspase家族的一员，在凋亡的信号传导、调节和执行过程中发挥关键作用［15］。本研究结果显示，GLP-1过表达促进了EPCs细胞增殖及PPARγ、C/EBPα mRNA表达，抑制了细胞Caspase-3 mRNA表达与Caspase-3活性。

SDF-1/CXCR4通路在内皮形成、血管生成以及造血等方面均发挥重要功能。有研究表明，SDF-1促进VEGF在内皮细胞上表达，是动员EPCs的重要细胞因子。SDF-1是CD34+造血祖细胞趋化因子，介导造血祖细胞的迁移，对祖细胞归巢到骨髓起重要作用［16］。对SDF-1基因敲除小鼠的研究表明，SDF-1/CXCR4在心血管的生成中发挥重要作用［17］。SDF-1/CXCR4可触发机体内多种信号转导通路，包括PI3K/Akt、核因子（NF）-κB、MAPKs与Ca2+内流等，这些途径被认为与细胞增殖与凋亡密切相关［13］。本研究证实，GLP-1是SDF-1/CXCR4通路的重要调控因子，并通过该通路调控EPCs的增殖、分化与凋亡。但由于体外实验与体内复杂的环境还存在一定差距，尚需进一步深入研究。

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（2014-11-03收稿 2015-01-05修回）

（本文编辑 陈丽洁）

GLP-1 regulates proliferation，differentiation and apoptosis of endothelial progenitor cells isolated from human umbilical cord blood by targeting the SDF-1/CXCR4 signaling pathway

LIU Feng1，XU Wenqiong1，MIN Na2，TANG Jiazhen1，HUANG Haihua1
1 Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China；2 The Third Affiliated Hospital of Nanchang University

Objective To investigate the molecular regulatory mechanism of glucagon like peptide 1（GLP-1）on proliferation，differentiation and apoptosis of human umbilical cord blood endothelial progenitor cells（EPCs）.Methods EPCs were isolated from the umbilical cord blood of healthy pregnant women and cultured in 6-hole cell plate at 2×105 density in vitro，transfected with empty vector plasmid（control group），pcDNA3-GLP-1 plasmid（GLP-1 group），pcDNA3-GLP-1plasmid+AMD3100（GLP-1+AMD3100 group）and simple AMD3100（AMD3100 group）.The pcDNA3-GLP-1 was transfected into EPCs.The 25μmol/L AMD3100 was used to block the SDF-1/CXCR4 signal pathway of EPCs for 1 h.The cell proliferation was determined by MTT method.The mRNA expressions of differentiation and apoptosis related genes PPARγ，C/EBPα and Caspase-3 were investigated by RT-PCR，and Caspase-3 activity was determined by Caspase-3 activity assay kit.Results Compared to control group，AMD3100 inhibitor showed no effects on cell proliferation，differentiation and apoptosis，while over-expression of GLP-1 in EPCs obviously promoted cell proliferation，and differentiation related genes PPARγ and C/EBPα mRNA expression，but down-regulated mRNA expression and the activity of Caspase-3 significantly（P＜0.05），indicating that GLP-1 increased proliferation and differentiation of EPCs while decreased cell apoptosis.When the SDF-1/CXCR4 signaling pathway was blocked by AMD3100，over-expression of GLP-1 induced promotion of cell proliferation，and the differentiation was decreased significantly and the apoptosis was significantly increased（P＜0.05）.Conclusion These data confirm that GLP-1 might promote EPCs proliferation and differentiation，and inhibit cell apoptosis through the regulation of the SDF-1/CXCR4 signaling pathway.

glucagon-like peptide 1；fetal blood；Caspase 3；cell proliferation；cell differentiation；apoptosis；endothelial progenitor cells；SDF-1/CXCR4；signaling pathway

R349.54

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.003

江西省自然青年基金（20114BAB215004）

1南昌大学第一附属医院内分泌科（邮编330006）；2南昌大学第三附属医院

刘峰（1980），男，副主任医师，博士，主要从事糖尿病及其并发症方面的研究