昙花总黄酮提取工艺研究

张振国，邹 翔，徐 阳，王 震，刘 影，赵静文，张逸乔，曲中原，季宇彬

(1.哈尔滨商业大学英才学院，哈尔滨150028;2.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076;3.哈尔滨商业大学药学院，哈尔滨150076)

《陆川本草》记载昙花[Epiphyllum oxypeta lum(DC.)]又名琼花、月下美人，属仙人掌科昙花属植物，其花、茎入药.昙花(Epiphyllum Flos)具有清肺止咳、凉血止血、养心安神之功效.主治肺热咳嗽、肺痨、咯血、崩漏、心悸、失眠等症[1].目前对昙花的研究主要集中在植物栽培和化妆品应用方面[2－3]，而对其药用价值并没有深入研究.中国科学院上海药物研究所吴斌等人对其化学成分进行初步研究，从昙花甲醇提取物的乙酸乙酯萃取部分分离出9个化合物，主要为黄酮类成分[3].黄酮类化合物具有多种生物活性，在食品和医药工业上有着广泛的应用.目前关于昙花黄酮类化合物的提取和活性研究还未见报道.本实验旨在单因素考查实验的基础上，通过正交试验优化昙花总黄酮的提取工艺，为进一步的药理活性研究及昙花药用植物资源的充分利用和合理开发提供实验依据.

1 实验仪器与药品

FW135、177中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);紫外可见分光光度计(北京普斯通用仪器有限公司);HH－2数显恒温水浴锅(江苏省坛市荣华仪器制造有限公司);98－1－B电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司);BS110S电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);RE－52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);SHZ－III循环水多用真空泵(上海亚荣生化仪器厂).

昙花(Epiphyllum Flos)药材为仙人掌科植物昙花[Epiphyllum oxypeta lum(DC.)]的干燥花，购于福建省泉州，为初秋采集花，经哈尔滨商业大学药学院张德连教授鉴定.金丝桃苷对照品购于天津一方可以有限公司，纯度98%以上.乙醇为分析纯.

2 实验方法

2.1 样品预处理

取干燥昙花，粉碎，过40目筛，待用.

2.2 昙花总黄酮的提取

精密称取处理好的样品粉末(40目)5.00g于圆底烧瓶中，按照一定的料液比、提取次数、提取时间、提取温度水浴回流提取.提取2次，合并提取液转至旋转蒸发仪浓缩至小体积，移至蒸发皿，水浴蒸干，用70%乙醇溶解定容至100 mL.

2.3 单因素实验设计

乙醇体积分数 精密称取5.00 g昙花粉末5份，固定提取温度为80℃，料液比为1∶30，提取时间为3 h，分别加入体积分数为50%，60%，70%，80%，95%的乙醇溶液进行回流提取.

提取温度精密称取5.00 g昙花粉末5份，固定提取溶剂为70%乙醇，料液比为1∶30，提取时间为3 h，提取温度分别为50、60、70、80、90 ℃进行回流提取.

提取时间精密取5.00 g昙花粉末5份，提取温度为80℃，提取溶剂为70%乙醇，料液比为1∶30，提取时间为 3 h，分别设定 2、3、4、5、6 h 进行回流提取.

料液比 精密称取5.00 g昙花粉末5份，提取温度为80℃，提取溶剂为70%乙醇，提取时间为3 h，料液比分别为 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 进行回流提取.

2.4 昙花总黄酮提取工艺的正交试验优化

根据单因素实验结果，以乙醇体积分数(A)、提取温度(B)以及提取时间(C)为实验因素进行考察，按照L9(34)正交表进行实验，进一步优化昙花总黄酮的提取工艺.因素水平如表1所示.

表1 实验因素水平L9(34)表

2.5 昙花总黄酮百分含量测定

2.5.1 金丝桃苷标准曲线的制备

精密称取金丝桃苷对照品10.00 mg，用无水乙醇定容至100 mL，则金丝桃苷对照品溶液的质量浓度为0.1 mg/mL.准确移取对照品溶液0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5 mL 至 10.00 mL容量瓶，分别加蒸馏水定容至10 mL，混匀，放置15 min后，用紫外分光光度计在378 nm处测量其吸光度[4－5]，以吸光值为纵坐标，金丝桃苷质量浓度为横坐标，绘制标准曲线.线性回归方程为 y=26.73x+0.016(r=0.999 6)，金丝桃苷在 0.01 ～0.06 mg/mL范围内呈良好的线性关系.

2.5.2 方法学考察

1)精密度实验 取金丝桃苷对照品溶液(0.1 mg/mL)在378 nm波长处连续6次测定吸光度，RSD值为0.17%，表明本实验精密度良好.

2)稳定性实验 取同一质量浓度的供试品溶液，于 0，2，4，8，10，24 h 测定吸光度值，RSD 为0.11%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定.

3)重复性实验 精密称取5.00 g昙花粉末6份，分别采用80%乙醇热回流提取，提取温度为90℃，提取4 h，料液比为 1∶40(m/V)，提取 2次，按照“2.2”项下制备成供试品溶液，在378 nm波长处测定吸光度值.RSD值为0.58%，表明实验重复性良好.

4)加样回收率实验精密量取昙花粉末(总黄酮百分含量为1.15%)6份，每份 0.1 g，分别加入金丝桃苷对照品约1 mg，分别采用80%乙醇热回流提取，提取温度为70℃，提取4 h，料液比为1∶40(m/V)，提取 2 次，按照“2.2”项下制备成供试品溶液，在378 nm波长处测定吸光度值，计算加样回收率为(97.10±1.38)%，RSD 值为1.03%，表明百分含量测定结果准确.

3 结果与讨论

3.1 单因素实验结果

单因素考察结果显示当80℃热回流提取，料液比1∶30，提取3 h时，乙醇体积分数为80%提取的总黄酮百分含量最高;当取70%乙醇，料液比1∶30，提取3 h时，提取温度为80℃提取的总黄酮百分百分含量最高;当80℃ 70%乙醇热回流提取，料液比1∶30时，提取时间为6 h的总黄酮百分含量最高;当80℃70%乙醇热回流提取3 h时，料液比大于1∶40(m/V)时昙花总黄酮百分含量增加趋于平缓，基本稳定.见表2.

表2 单因素实验结果

3.2 正交试验结果

根据单因素实验结果，选择乙醇体积分数、提取温度以及提取时间的较好水平进行正交试验，进一步优化昙花总黄酮的提取工艺.正交试验结果如表3所示.从分析结果来看，乙醇体积分数、提取温度和提取时间对昙花总黄酮的百分含量均有影响，影响的大小顺序为:乙醇体积分数＞提取温度＞提取时间.根据正交试验的结果(总黄酮的百分含量)，得出昙花总黄酮提取的最佳实验条件为A2B3C2，即乙醇体积分数为80%，提取温度为90℃，提取时间为4 h.

3.3 验证实验

按照优选出来的最佳工艺条件进行验证实验，测定平均总黄酮百分含量为 1.18%，RSD为1.84%，工艺稳定.见表3、4.

表3 正交试验设计及实验结果

表4 正交试验结果方差分析

4 结语

通过以上研究可知乙醇体积分数，提取温度、提取时间以及料液比对昙花总黄酮的百分含量均有影响.正交试验确定的因素影响的大小顺序为乙醇体积分数＞提取温度＞提取时间.昙花总黄酮提取的最佳实验条件为乙醇体积分数80%，提取温度90℃，提取时间4 h，料液比1∶40(m/V)，提取2次.该工艺操作简便、可行，为昙花总黄酮的工业化生产提供科学依据，为昙花作为药用资源进行开发和利用奠定基础.

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社，1999.864－865.

[2]SUZAKI S.Moisturizing effect of Gekkabijin(Epiphyllum oxypetalum Haw.)extract[J].Fragra J，2005，33(10):51 －56.

[3]吴 斌，林文辉.昙花化学成分的研究[J].中国药学杂志，2010，45(7):496－499.

[4]曾秀燕，鲁梅玉，杨常宏，等.醋柳黄酮中总黄酮及槲皮素、异鼠李素的含量测定[J].中国医院药学杂志，2005，25(12):1122－1124.

[5]张 慧，王 遂.双水相法和微波法提取假酸浆中总黄酮及纯化[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版，2014，30(2):220－223