台盼蓝活细胞计数法检测中药复方对血管平滑肌抑制作用

王萌 杨晓琨

摘要：目的观察辛通畅络中药复方对慢性肾脏病心血管危险因素的改善作用。方法大鼠按每天15 g/kg剂量，灌胃给药，连续灌服10（1，于最后一次给药后2～3h，股动脉放血，分离血清，即为中药血清，经560C，30 min灭活后，分别配成含10、20、30%中药血清的培养液备用，以正常大鼠血清为对照。用含辛通畅络中药处方不同浓度血清培养血管平滑肌细胞，用台盼蓝活细胞计数法及四甲基偶氮唑蓝（MrIr）法分别检测活细胞数目和细胞生长抑制率。结果 实验结果显示：24 h.72 h经不同药物浓度血清培养后，与对照组相比，培养24 h后，20%药物组.30%药物组均较其在统计学上有显著差异（P<0.01）；培养72 h后培养24 h后，10%药物组较对照组在统计学上有显著差异（P<0.05），20%药物组.30%药物组均较其在统计学上有显著差异（Jp<0.01），结论 揭示辛通畅络中药复方抑制血管平滑肌细胞增殖，从而防治慢性肾脏病早期动脉粥样硬化所致的血管重构。

关键词：慢性肾脏病；辛通畅络中药复方；血管重构

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1007 - 2349（ 2015） 03 - 0060 - 02

心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）是慢性肾脏病（ chronic kidney disease，CKD）患者中最常见的并发症，相关资料显示，CKD病人死于CVD者在其总死亡率中高达30%～50%[1]。目前，如何干预CKD患者的CVD，尚缺乏足够的循证医学依据。因此，在中医药领域内寻求有效的治疗方法和药物，是基础与临床领域面临的重要课题。依据辛通畅络中药复方可以有效改善FSGS大鼠肾脏功能指标，减轻肾脏病理形态学损害，同时辛通畅络法中药复方具有调节大血管重构的作用，本实验通过确定辛通畅络中药复方对体外血管平滑肌细胞增殖的影响，以期从细胞、分子水平解析该中药复方防治动脉粥样硬化、调节大血管重构减少心血管并发症的机制，为该复方临床应用提供更充分的理论依据。1 实验材料及方法1.1 辛通畅络中药复方药物血清的制备①辛通畅络中药复方的组成：柴胡12g，黄芩10g，生黄芪30g，当归10g，女贞子15g，泽兰15g，水蛭10g，细辛3g；②上8味药共煎煮3次，浓缩成100mL，汁液（4g生药/mL），无菌装瓶密封，以上各药均经天津市药品检验所核定；③实验动物选用Spragoe -DawlPg（ SD）远交系健康大鼠48只，均为雄性，体重（250 -300）g，SPF/VAF'级，南北京华阜康生物科技股份有限公司提供（合格证号：SCXK京2009 - 0007）；④实验设备和试剂：实验设备和试剂：胎牛血清、台盼蓝、四甲基偶氮唑蓝、胰蛋白酶、DMEM均由天津子涵生物科技有限公司提供。

实验方法：大鼠按每天15g/kg剂量，灌胃给药，连续灌服10天，于最后一次给药后2～3 h，股动脉放m，分离血清，即为中药m清，经56℃，30 min灭活后，分别配成含10、20、30%中药血清的培养液备用，以正常大鼠血清为对照。1.2 血管平滑肌细胞培养和鉴定 用组织贴块法培养VSMC，经α-actin免疫组化鉴定为VSMC，第3-5代细胞用于实验。2 实验生化检测指标和方法

用台盼蓝活细胞汁数法检测活细胞数日细胞以1.0×105个/L的密度种于24孔板，培养24h后以无血清DMEM静息24h，换成8%胎牛血清的DMEM培养液，分为对照组和不同浓度加药组，每组设6个复孔，培养24 h、72 h后，分别以0. 25%胰蛋白酶消化细胞，取50μL，细胞悬液与50μL0.4%台盼蓝溶液混匀，台盼蓝溶液终浓度为0.2%。取一滴混匀悬液加入血细胞计数板，镜下计数活细胞数。3统计学分析

实验数据统计采用SPSS13.0统计学软件进行分析，各组实验数据以均数±标准差表示，总体数据进行组间单因素方差分析 （One Way ANOV），显著性差异水平设定为P<0.05。4实验结果

实验结果显示：24 h、72 h经不同药物浓度血清培养后，与对照组相比，培养24 h后，20%药物组、30%药物组均较其在统计学上有显著差异（P<0.01）；培养72 h后培养24 h后，10%药物组较对照组在统计学上有显著差异（P<0.05），200药物组、30%药物组均较其在统计学上有显著差异（P

揭示辛通畅络中药复方抑制血管平滑肌细胞增殖，从而防治慢性肾脏病早期动脉粥样硬化所致的血管重构6讨论

肾脏病患者往往同时存在高血压、高血脂、蛋白尿、低蛋白血症、血尿、贫血、钙磷失调等，战在慢性肾脏病的早期出脱动脉粥样硬化和动脉硬化，从而导致血管病变即血管重构。血管重构是指机体在生长、发育、衰老和疾病过程中，血管为适应内、外环境（特别是力学环境）的变化而发生形态、结构和功能的一系列适应性改变，足机体对血流动力学长期改变而发生的一种适应性反应和病理生理学过程[2]，血管重构的中心环节是血管平滑肌细胞的增殖、凋亡和重组。动脉重构是一此心血管疾病共同的重要的病理生理改变和发病基础，故而抑制动脉重构是减少慢性肾脏病心血管疾病的的重要环节，对降低其发病率和病死率具有重要意义。在慢性肾脏病的早期往往已出现心血管并发症，其发生率随肾功能进展而增加，至终末期肾病（ ESRD）时达最高峰。

依据FSGS及其心血管病变足以气推动力虚损，枢机不利，湿浊瘀毒蕴结，心肾脉络损伤为基本病机，本课题以辛通畅络，益气和血为法，筛选组合既往临床观察具有疗效优势的中药复方为中医干预观察药物。

辛通畅络中药复方建立的以疏利少阳法为主，融益气养阴，清热利湿，辛通畅络、活血化瘀为一体的中药复方制剂。在证实了肾络宁能有效改善FSCS大鼠肾脏功能指标，减轻肾脏病理形态学损害等实验结果的基础上[3]，本研究针对慢性肾脏病患者近半数死于严重心血管并发症的这一严重社会问题，探讨肾络宁对防治动脉粥样硬化、调节大血管重构的作用机制，为减少慢性肾脏病患者心血管并发症的发生、提高CKD患者生存率和生活质量提供理论依据。

实验结果表明辛通畅络中药复方能够抑制平滑肌细胞增殖，调节大血管重构，提示肾络宁具有可推迟动脉硬化、动脉粥样硬化发生的作用，从而降低心血管疾病的危险性，揭示了该药物不仅仅是通过改善肾功能异常来减少心血管病发病的危险性，同时本身具有减少慢性肾脏病的心血管疾病的作用，最终提高慢性脏病患者生存率和生活质量。研究辛通畅络中约复方改善慢性肾脏病心血管疾病的机制及扩大使用范围奠定基础。参考文献：[1] Bleumink GSS，An11dFCS，Miriam CJM，et al.Genetic polymorphism andheart failure. GenetMed ，2004，6（6）：465-474.[2]李元，龚文辉.血管重建及影响因素[J].滁州学院学报，2002，7（1）：117 -120[3]杨晓琨，辛通畅络法对FSGS肾病大鼠心血管的重构作用及机制研究[博十学位论文].天津：天津中医药大学，2010

（收稿日期：2014-10-21）