RP —HPLC法测定鞣云实素在不同PH条件下的含量变化

范源 徐国发 张建博 陈平 邓珏力 林青

摘要：目的研究和分析鞣云实素在不同PH磷酸盐缓冲液中的含量变化情况。方法采用在60℃的恒温条件下观察鞣云实素在不同PH的磷酸盐缓冲液（PH分别为l、2、3、4、5、6、7、8）中的水解情况，应用反相高效液相色谱仪测定鞣云实素及其水解产物没食子酸含量，并比较和分析鞣云实素样品液水解前后鞣云实素和没食子酸含量变化。结果缓冲溶液PH值在l～3范围内，鞣云实素随着PH值的上升，其含量呈逐渐上升的趋势，PH值在4～8范围内，鞣云实素随着PH值的上升，其含量呈逐渐下降的趋势，在PH值J～3范围内没食子酸含量呈逐渐下降的趋势，PH值在4～7的范围内，没食子酸含量呈逐渐上升的趋势，PH值在7～8的范围内，没食子酸含量呈下降的趋势。其中在PH值为l时鞣云实素的水解产物没食子酸含量最高，在PH值为3时没食子酸含量最低；结论鞣云实素在不同PH条件下的含量变化反映了酸碱度对鞣云实素水解反应的影响，本实验研究可为含鞣云实素的中药提取加工、养护、药效学、稳定性研究等方面的应用提供一定参考。

关键词：鞣云实素；水解；没食子酸；PH磷酸缓冲液

中图分类号：R284

文献标志码：A

文章编号：1007-2349（2015） 01-0065-03鞣云实素（ Corilagin）是一种多酚类化合物，别名柯里拉京、鞣云实精，呈白色针晶状粉末，分子式为C27H22018[1]，其化学结构见下图。易溶于乙醇、甲醇、丙酮、稍溶于水。在冷水中溶解度小，容易被氧化和水解，样品应置于阴暗低温处避光保存[2-3]、鞣云实素存在于多种药用植物中，其中叶下珠（Phyllanthus reticulatus）、橄榄（Canarium album）、余甘子（ Phyllallt11IIs enlblica）、老鹳草（Ceranium wilfordii）、龙眼（Di-mocarpus longana）等植物含量较多[4-7]。 药理学研究表明，鞣云实素具有抗炎、保肝、抗- HIV、抗肿瘤、抗高血压、抗氧化等多种生物活性，尤其在抗肿瘤、抗氧化方面药效良好[8-13]。鞣云实素含有糖苷键，易水解断裂脱落下一分子的没食子酸，本实验根据鞣云实素和没食子酸的理化性质，运用RP - HPLC法测定不同PH值条件下鞣云实素及水解产物没食子酸的含量变化。1 实验材料与仪器1.1实验药品鞣云实素样品（购自上海同田生物技术有限公司）；鞣云实素对照品（购自上海同田生物技术有限公司）；没食子酸对照品（购自昆明中检所）；1.2仪器与试剂高效液相色谱仪（Agilent1200型）；分析天平；电子天平；精密PH测定仪计（0. 01pH）；恒温水浴锅；恒温干燥箱；移液管；烧杯；玻璃棒；容量瓶；0.45um微孔滤膜；ImL注射器；无水甲醇（色谱纯）；无水乙醇（色谱纯）；磷酸（分析纯）；磷酸氢二钠（分析纯）；醋酸（分析纯）；纯化水。2实验方法2.1 磷酸盐缓冲液的配制 A液：取磷酸10 mL，加纯化水至100 mL，摇匀。B液：称取磷酸氢二钠7.163 g，加纯化水使溶解成100 mL。分别取上述不同体积的A液和B液混合配制成不同PH（1、2、3、4、5、6、7、8）的磷酸盐缓冲溶液，即得。2.2 对照品溶液的制备取没食子酸对照品适量，于分析天平上精密称定，加50%甲醇溶解配制定容成每l mL含25μg的溶液，即得；取鞣云实素对照品适量，于分析天平上精密称定，用20%乙醇溶解定容成每lmL含20μg的溶液，即得。2.3供试品溶液的制备 取鞣云实素样品适量，精密称定5. 730 mg.以20%乙醇溶解定容配制成10 mL样品溶液，取移液管分别吸取制备好的鞣云实素样品溶液0.4 mL，放入固定体积的不同PH的磷酸盐缓冲液中，超声使其溶解混匀，以600C恒温水浴锅控制水浴环境温度在（60±0.5）℃，让鞣云实素样品溶液在恒温条件下充分水解2h，对水解后的样品液用微孔滤膜（0. 45 um）进行过滤，即得供试品溶液。2.4色谱条件2.4.1鞣云实素色谱条件 色谱柱ZoRBAX SB - C18柱（4.6 x250 mm，5 um）；流动相：甲醇-0. 4%醋酸（22：78）；柱温：250C；检测波长：268 nm；流速：1 mL/min；进样量：20 uL[14]。2.4.2没食子酸色谱条件 色谱柱ZoRBAX SB - C18柱（4.6 x 250 mm，5 um）；流动相：甲醇-0. 2%磷酸（5：95）；柱温：25℃；检测波长：273 nm；流速：1mI/min；进样量：10 uL。2.5标准曲线的绘制2.5.1 鞣云实素标准曲线的绘制 于分析天平上精密称定鞣云实素对照品2. 860 mg，以20%乙醇溶解定容成25mL，配制成每1mL含0.1144 mg的溶液，分别取上述对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL放入10 mL容量瓶中，用20%乙醇溶液稀释至刻度配制成不同浓度的对照品溶液，按上述鞣云实素色谱条件进样，以鞣云实素的峰面积（Y）对标准品的浓度（X）进行线性回归，得回归方程Y= 24877X - 68. 267，r=0.9987，结果表明：鞣云实素的峰面积值与浓度有良好的线性关系，线性范围为：0. 0572 ug -0. 572 ug。2.5.2没食子酸标准曲线的绘制 取没食子酸对照品适量，于分析天平上精密称定4. 45 mg，加50%甲醇溶解配制定容成25 mL，分别取上述对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀释至刻度配制成不同浓度的对照品溶液，按上述没食子酸色谱条件分别进样，以没食子酸的峰面积（Y）对标准品浓度（X）进行线性回归，得方程Y=23542x一1.7214，r=0.9995，结果表明：没食子酸峰面积值与浓度有良好的线性关系，线性范围为：0. 089 ug -0. 89 ug。2.6鞣云实素和没食子酸的含量测定 分别取2.3项下方法制备的供试品溶液，按2.4色谱条件分别测定鞣云实素、没食子酸在不同PH的磷酸盐缓冲液条件下的含量，用标准曲线法进行计算。3 实验结果与分析3.1 不同PH条件下鞣云实素和没食子酸含量变化 见表1。3.2表l显示：在缓冲液PH值为l～3的区间，随着PH值的增大，鞣云实素含量逐渐增加，没食子酸含量逐渐减少，且当缓冲液PH值等于l时，没食子酸的含量最高，当缓冲液PH值等于3时，没食子酸含量最低。表明在较酸性条件下，鞣云实素酯键断裂水解产生较多的没食子酸。3.3 从图（3、4）中可以看出，当PH 4～7的范围内，鞣云实素含量逐渐下降，没食子酸含量上升，PH 6～7范同鞣云实素含量急剧卜-降，而没食子酸含量上升缓慢，大部分鞣云实素可能没有水解出没食子酸，其有可能被氧化或水解成其他化合物。当PH 7—8时鞣云实素含量下降，而没食子酸含量也在下降，鞣云实素水解产生没食子酸的速度小于没食子酸消耗的速度.上述结果可能和没食子酸在碱性条件下不稳定而产生红棓酚等物质有关[15]。4结论鞣云实素是存在于多种药用植物中的活性成分，其有较重要的药效学功效。本实验结果所显示鞣云实素在不同的PH值条件下的含量变化提示鞣云实素的酯键或苷键在酸性条件下可能更容易断裂产生没食子酸。进一步研究并分析鞣云实素的理化特性，可为进一步研究含鞣云实素的中药加工工艺、质控、养护及药效学提供一定的参考.参考文献：[l]陈玉武，蜜柑草抗癌有效成份研究Ⅱ.多酚类成分的分离与 鉴定[J].中草药，1997，28（4）：198 -202.[2]万振先.叶下珠化学成分的研究[J].中草药，1997，28（3）：134 - 135.[3]沙东旭，叶下珠化学成分的研究[J].沈阳药科大学学报，2000，17（3）：176 - 178.[4]陈玉武，蜜柑草抗癌有效成份研究Ⅱ.多酚类成分的分离与鉴定[J].中草药，1997，28（4）：198 -202.[5] Kumaran A，et al. Nitric oxide radical scavenging active components from Phyllanthus emblica L[J]. Plant Foods Hum Nutr. ，2006，61（1）：l一5.[6]S Kinoshita et al.Free radical scavenging action of meclicinal herbs from Mongolia[J].Phytomedicine ，2007 ，14（11）：755-762.[7]张树峰，明艳林，林毅，等.叶下珠属植物活性成分柯里托京研究进展[J]植物科学，2010，39（4）：79 -83.[8] Xu H X， et al.Inhibitory activity of flavonoids and tannins against HIV-l protease[J].Biol Pharm Bull. 2000 ，23（9）：1072 - 1076.[9]沈志强，叶下珠有效部位的溶栓作用及其对PAI -l和tPA活性的影响[J].天然产物研究与开发，2003，15：441-445.[10] Zhao S L，et al.Preliminary exploration on anti - inflammatory mechanism of Corilagin[ beta -I -O- galloyl -3，6-（ R） – bexa hydroxydiphenoyl -d - glucose] in Vitro[J].Int Immunopharmacol，2008，8（7）：1059 - 1064.[11]刘朝阳.柯里拉京抗肿瘤和致突变作用实验研究[J].肿瘤防治杂志，2003，10（5）：469 - 472.[12]刘朝阳.柯里拉京抗肿瘤作用的研究[J].肿瘤防治研究，2002，29（5）：356 -358. [13] Luoqi Jia， Hongyan Jin， Jiayi Zhou， et al，A potential anti – tumor herbal medicine，Corilagin，inhibits ovarian Cancer cell growth through blocking the TCF -p signaling pathways[J].BioMed Central. 2013，33 （13）：1- 11.[14]陈晓北，HPLC法测定珠子肝泰分散片中鞣云实精的含量[J].辽宁压亏院学报，2008，29（1）40 -43.[15]张迎杰，傅杰，刘林，等，没食子酸在含盐酸高温液态水中的稳定性[J].化学反应工程与-二艺，2013，29（2）：189-19.（收稿日期：2014-11-10）