超分子类肽纳米片层的全自动高通量制备

覃茂昌，郑晖，胡志远，李勤1

（1. 北京理工大学生命学院，北京 100081；2. 国家纳米科学中心,纳米生物效应与安全性研究室, 北京 100190；3. 中国科学院化学研究所,活体分析化学实验室, 北京 100190；4. 长三角（嘉兴）纳米科技产业发展研究院，浙江嘉兴 314000）

类肽（peptoid）是以N-取代甘氨酸为单元，与多肽结构相似的非天然折叠体[1,2]。它可以折叠成高生物活性[3,4]和高特异性的功能单元[5]，且其组成单元比多肽更丰富[6]，并能够耐受蛋白酶[7]，因此近年有关类肽的研究日益增长，它也在生物和医学上有广泛的应用[8,9]。经过良好设计，类肽还可以形成高度有序的超分子纳米片层[10]，甚至形成具有宏观尺度的纳米平面材料[11,12]，从而具有众多应用前景，例如可能发展为具有类似蛋白活性的分子识别和催化的功能材料[9]。

尽管二维类肽纳米材料在生物和医学研究上具有重要意义[13,17,18]，精确合成这样的材料仍有很大困难。Zuckermann团队用朗缪尔槽和Wilhemy平板装置测量了类肽溶液气-液表面界面压缩和表面张力的关系，发现类肽纳米片层的形成所遵守的机制[14～16]。实验表明，两亲性类肽分子在气-液表面自组装形成单分子层，这样的单分子层在界面压缩作用下向液面塌陷，形成稳定的类肽双分子层结构，疏水部分朝向双分子层内侧，亲水部分暴露在外。由于其纵向厚度在纳米量级，这些类肽双分子层又被称作类肽纳米片层（peptoid nanosheet）。虽然朗缪尔槽可以用于制备类肽纳米片层材料，但存在一些明显不足。如其中的溶液容易蒸发且易被污染，并且该设备尺寸较大、造价较为昂贵且原料消耗较大，但长链类肽合成成本较高，因此使用朗缪尔槽作为反应器非常不经济，需要开发更经济更简便的专用方法和专用设备。

本研究开发了一种小型合成仪器，利用类肽溶液气-液表面积的周期性的压缩，以达到模拟朗缪尔槽的施力过程，从而能够形成稳定的类肽纳米片层。每个反应均在各自的反应瓶中进行，大大减少了类肽原材料的耗费，且一次运行可以合成最多40种类肽纳米片层，从而实现类肽纳米片层的自动化、高通量制备。

1 实验部分

1.1 类肽分子的合成

本文采用了微调条件后的固相亚单元法进行类肽的合成[18]，将负载量0.30mmol/g的Rink amide AM树脂（吉尔生化，中国）加入50mL多肽合成管中，后加入2M溴乙酸（98%，Alfa Aesar，中国）的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（99.5%，北京化工厂，中国）溶液（3.2M N，N-二异丙基碳二亚胺（DIC）（99%，Alfa Aesar，中国）为缩合剂）酰化树脂末端的氨基在37摄氏度条件下反应30min。再加入2M伯胺在37摄氏度反应90min以取代掉溴。通过重复上述步骤完成分子的合成，在合成完成后通过95%三氟乙酸（TFA）（99%，aladdin，中国），2.5%的超纯水和2.5%三异丙基硅烷（Tips）（98%，Acros，比利时）反应2h将类肽从树脂上裂解下来并移出侧链保护基团，经过稀释并冻干后用高效相色谱（HPLC）（E2695,Waters,美国）纯化并用质谱（MS）（H-CLASS,Waters,美国）进行鉴定。

1.2 类肽纳米片层的合成

取适量干粉类肽溶于比例为2:1的二甲基亚砜（DMSO）（99.5%，Sun，中国）与超纯水的混合液中，使其形成2mM的类肽母液。取5μL的功能类肽母液加入895μL的超纯水与100μL的缓冲液配制形成10μM的功能类肽纳米片合成液。缓冲液是由10mM的三羟甲基氨基甲烷（Tis-HCl）（Solarbio，中国）和100mM的氯化钠（NaCl）（99.5%，北京化工厂，中国）组成，此环境下缓冲液的PH值为8.0。

用移液枪取1mL类肽纳米片合成液移到反应瓶中，置反应瓶于载物台上。设定软件控制载物台的正转停留角度为90°、反转停留角度为4.5°、正转停顿时间为0、反转停顿时间为450s、总回合数为200（运行时间大约为24h）以及正反旋转速率为0.4rpm，运行超低速类肽纳米片层合成仪器。

1.3 基于荧光显微镜类肽纳米片层的表征

用移液枪取10μL的100μM的尼罗红（Nile Red）（95%，Solarbio，中国）染料，加入到用超低速类肽纳米片层合成仪制备结束后的反应瓶中染色类肽纳米片层5min，再取2μL染色后的类肽纳米片层溶液移到厚度大约为3-4mm的1%的琼脂糖（agarose）透明基片上，置于倒置荧光显微镜（AxiO Vert.AI）下，红色荧光通道观察类肽纳米片层合成结果（图4）。

2 结果与讨论

2.1 类肽分子序列的设计

用于类肽纳米片层制备的类肽分子必须具备两亲性。所设计的类肽分子是由亲水部分的氨基、羧基和疏水部分的苯环三个部分所组成的28个序列类肽（图1 a）。

由类肽分子形成纳米片层结构的原理如下图1的b所示。反应瓶水平放置，使得类肽溶液气-液界面面积充分大，静置类肽溶液后，类肽分子通过亲水性和疏水性的相互作用，在溶液界面形成亲水部分为液面下、疏水部分为液面上的自由分子层。接着通过旋转反应瓶，使溶液界面面积缩小，类肽分子之间通过电荷相互作用在溶液界面形成致密分子层。继续旋转反应瓶，压缩溶液界面面积，类肽分子带氨基和羧基的亲水部分在界面压缩的作用下，会包裹疏水部分的苯环在液相形成纳米片层结构。

2.2 超低速类肽纳米片层合成仪的设计

超低速类肽纳米片层合成仪的设计原理正是通过压缩两亲性类肽溶液的界面面积，使类肽分子的亲水部分暴露在外侧，疏水部分包裹在内侧，形成稳定的类肽纳米片层。

通过周期性地改变类肽溶液的表面积，也可以实现对界面溶液的规律性挤压，从而促进形成纳米片层。基于这一想法，我们对反应瓶中液体的表面积变化建立了模型，并加以分析。

假设反应瓶（内径为1cm、高为3.5cm的圆柱体玻璃瓶）所加的类肽溶液不超过其体积的一半，则其从水平位置旋转到垂直位置溶液界面面积需经过的不同的四种状态（图2 (a)中的a、b、c、d）。此时，反应瓶中溶液界面面积分别经过三个变化过程（图2 (a)中的e、f、g）。反应瓶中溶液界面面积的变化与反应瓶旋转角度之间的关系对应于如下的公式1。

对公式1用MATLAB拟合分析，反应瓶从水平位置旋转到垂直位置，当其旋转角度从初始状态的4.5°变化到90°时，类肽溶液界面面积缩小为初始状态的24%(图2 b)。借助自动化手段，使反应瓶以一个慢的角速度（小于1rpm）进行转动，则能实现形成类肽纳米片层结构所需的类肽溶液气-液界面面积压缩过程。

在利用朗缪尔槽实验装置进行类肽纳米片层制备时，需要以100cm2/min的速率压缩10μM浓度的类肽溶液的两相界面，使其表面积从80cm2被挤压到20cm2，即界面面积缩小为原面积的1/4需要用36s。对应于在上述模型，反应瓶从初始状态的4.5°旋转到90°时，类肽溶液界面面积缩小为初始状态的24%，这个过程需要38s，即反应瓶约以0.4rpm的角速度旋转4.5°到90°。

经过以上分析，利用自动化设备控制反应瓶旋转，进行类肽纳米片层的制备是可行的。本文专门设计了一种简单的类肽纳米片层合成仪器——超低速类肽纳米片层合成仪器（图3）。该设备较为小巧，可以取代价格昂贵、体积较大的朗缪尔槽，用于小量类肽纳米片层的高通量、快速制备。

本类肽纳米片层合成仪由载物台、驱动单元、控制单元和固定单元构成，其中驱动单元包括直流电机、蜗轮蜗杆减速装置、同步带轮及传送带，而控制单元主要有增量式光电编码器、光电开关、电路板和控制软件。载物台、驱动单元和控制单元通过固定单元的转接件相互固定连接，从而形成一体化、自动化的类肽纳米片层合成仪器（图3 a）。

类肽纳米片层合成仪器的驱动单元通过与蜗轮蜗杆减速装置固定连接的直流电机驱动同步带轮旋转的方式，稳定带动载物台的低速旋转，间接的实现反应瓶中溶液界面面积的变化。并且载物台可以放置40个反应瓶，实现类肽纳米片层的高通量制备（图3 a,b）。

与此同时，载物台的旋转过程又被控制单元的光电开关和增量式光电编码器反馈出其所在的位置和旋转的角度，使控制单元可以通过电路板和上位机控制软件自动化的控制载物台的正反转的速率、角度、停顿时间和总运行时间，同时实时监控其运行状态（图3 c）。从而实现类肽纳米片层的自动化制备。

本类肽纳米片层合成仪所能实现的稳定带动反应瓶低速度旋转的程度主要由驱动单元的直流电机、蜗轮蜗杆减速装置和同步带轮以及控制单元的电路板电路及控制程序决定。该仪器采用与蜗轮蜗杆减速装置固定连接输出额定转速为3rpm、转矩为3N·m的直流电机，通过2:1的同步带轮减速，使其能稳定带动载物台以1.5rpm的转速转动。载物台的进一步减速由电路板的PWM驱动程序实现，并且经测试本类肽纳米片层合成仪器能稳定的带动载物台的实际转速范围为0.24～1.12rpm（图2 c），使其可以满足反应瓶制备类肽纳米片层所需要的超低速速率。

2.3 类肽纳米片层的制备

利用所研制超低速类肽纳米片层合成仪，进行了类肽纳米片层的制备。经尼罗红染色后荧光显微镜下观察，仪器制备的肽纳米片层面积大（约30μm*100μm）、边缘平滑清晰（图4）与朗缪尔槽试验装置制备结果比较达到了相近的效果。

2.4 利用类肽纳米片层合成仪制备类肽纳米片层条件的优化

由于类肽纳米片层的自组装主要在溶液的气-液界面进行，因此，除了类肽分子的自身性质和溶液浓度外，类肽分子能否在溶液界面达到稳定，以及所施加界面压力大小是否适合，是影响纳米片层制备的主要因素。因此，我们摸索了载物台的旋转速率和每回合的停顿时间对类肽纳米片层制备效果的影响（表1）。

类肽纳米片层合成仪器载物台以0.3rpm的转速旋转时，类肽溶液界面面积缩小为初始状态的24%需要47.5s。此时，仪器能提供的界面压力过小，每次压缩结束后，不管溶液在界面面积最大处静置时间多长，都无法形成类肽纳米片层（图5 a、b、c）。

增大载物台旋转速率到0.4rpm时，类肽溶液界面面积在35.6s内被压缩到初始状态的24%。此时，设置反应瓶在4°位置静止225s，类肽溶液在界面面积最大处静置的时间较小，所形成的类肽纳米片层也相应较小（图5 d）。提高静置时间到450s，较多的类肽分子在溶液界面形成单分子层，压缩界面后形成的类肽纳米片层大且规整（图5 e）。继续提高静置时间到900s，此时，静置过程中一定量的纳米片层由于重力作用会下沉到液面下，在再挤压的过程中所形成的类肽纳米片层易折叠和重合（图5 f）。

继续增大超低速类肽纳米片层合成仪器载物台的旋转速率，使其以0.9rpm的转速旋转，溶液界面面积从最大压缩到最小只需要15.8s。此时仪器对类肽溶液界面施加的表面压力过大，所形成的类肽纳米片层易重合和折叠（图5 g、h、i）。

3 结论

目前，类肽的研究正在迅速地发展，对其结构和性能的研究也在不断深入。类肽分子经自组装成高级结构后，可以修饰其他功能基团或分子标记，用于分子识别、催化、传感器等方面的研究，在生物化学、药学等领域有广阔前景。本文所设计的小型化的超低速类肽纳米片合成仪器，可以自动化、高通量的制备类肽纳米片层，与朗缪尔槽实验装置相比，具有体积小、速度快、消耗样品少等优点，从而为类肽研究提供有力的工具。此外，对于其它很多具有两亲性的分子而言，本仪器也有望作为一种通用的两维材料制备工具。

[1] Park S, Kwon Y U. Facile solid-phase parallel synthesis of linear and cyclic peptoids for comparative studies of biological activity[J].ACS combinatorial science, 2015: 17(3): 196-201.

[2] Renfrew P D, Craven T W, Butterfoss G L,et al.A rotamer library to enable modeling and design of peptoid foldamers[J]. Journal of the American Chemical Society, 2014:136(24):8772-8782.

[3] Liu Y, Knapp K M, Yang L,et al.High in vitro antimicrobial activity of beta-peptoid-peptide hybrid oligomers against planktonic and bio fi lm cultures of Staphylococcus epidermidis[J]. International journal of antimicrobial agents, 2013: 41(1): 20-27.

[4] Skovbakke S L, Larsen C J, Heegaard P M,et al.Lipidated alphapeptide/beta-peptoid hybrids with potent anti-inflammatory activity[J]. Journal of medicinal chemistry, 2015: 58(2): 801-813.

[5] Martelli G, Monsignori A, Orena M,et al.Beta-Peptoids: synthesis of a novel dimer having a fully extended conformation[J]. Amino acids, 2012, 43(5): 2005-2014.

[6] Laursen J S, Engel A J, Fristrup P,et al.Cis-trans amide bond rotamers in beta-peptoids and peptoids: evaluation of stereoelectronic effects in backbone and side chains[J]. Journal of the American Chemical Society, 2013, 135(7): 2835-2844.

[7] Turner J P, Lutz R T, Moore K A,et al.Rationally designed peptoids modulate aggregation of amyloid-beta 40[J]. ACS chemical neuroscience, 2014: 5(7): 552-558.

[8] Chongsiriwatana N P, Patch J A, Czyzewski A M,et al.Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(8): 2794-2799.

[9] Sun J, Zuckermann R N. Peptoid polymers: a highly designable bioinspired material[J]. ACS nano, 2013, 7(6): 4715-4732.

[10] Olivier G K, Cho A, Sanii B,et al.Antibody-mimetic peptoid nanosheets for molecular recognition[J]. ACS nano, 2013, 7(10):9276-9286.

[11] Baek K, Yun G, Kim Y,et al.Free-standing, single-monomerthick two-dimensional polymers through covalent self-assembly in solution[J]. Journal of the American Chemical Society, 2013,135(17): 6523-6528.

[12] Beaman D K, Robertson E J, Richmond G L. From Head to Tail: Structure, Solvation, and Hydrogen Bonding of Carboxylate Surfactants at the Organic–Water Interface[J]. The Journal of Physical Chemistry C,2011, 115(25):12508-12516.

[13] Butler S Z, Hollen S M, Cao L,et al.Progress, challenges, and opportunities in two-dimensional materials beyond graphene[J].ACS nano, 2013, 7(4): 2898-2926.

[14] Sanii B, Haxton T K, Olivier G K,et al.Structure-determining step in the hierarchical assembly of peptoid nanosheets[J]. ACS nano,2014, 8(11): 11674-11684.

[15] Sanii B, Kudirka R, Cho A,et al.Shaken, not stirred: collapsing a peptoid monolayer to produce free- fl oating,stable nanosheets[J]. Journal of the American Chemical Society,2011, 133(51): 20808-20815.

[16] Tran H, Gael S L, Connolly M D,et al.Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highlyordered nanosheets[J]. Journal of visualized experiments: JoVE,2011(57): e3373.

[17] Ellen J. Robertson, Gloria K. Olivier, Menglu Qian, Caroline Proulx,Ronald N. Zuckermann, and Geraldine L. RichmondAssembly and molecular order of two-dimensional peptoid nanosheets through the oil-water interface[J]. PNAS,2014,9(16):13284-13289.

[18] Goff D A, Zuckermann R N. Solid-Phase Synthesis of Highly Substituted Peptoid 1(2H)-Isoquinolinones[J]. The Journal of Organic Chemistry, 1995, 60(18): 5748-5749.