5种克拉霉素相关物杂质分析方法研究

马步芳，孙立权，张梦南，姚国伟，罗爱芹

（北京理工大学生命学院，北京 100081）

克拉霉素（CAM, clarithromycin）于上世纪90年代由日本大正制药株式会社发现、由美国雅培公司开发成功的一种半合成抗生素[1～3]，其抗菌活性强、药代动力学性能好[4]，能够治疗幽门螺旋杆菌引起的胃溃疡而成为了临床上不可或缺的药物[5]，已经进入我国基本药物目录[6]。随着检测技术水平的提高，该药物的药典标准也在逐步提高。克拉霉是以红霉素A经过结构修饰而得到的[7,8]，由于结构的相似性，原料红霉素A的杂质、合成过程的中间体、反应的副产物以及降解产物等都可能成为克拉霉素杂质而影响其质量[9]。某些杂质在生产过程中难以除去而残留在克拉霉素中，被称作克拉霉素相关物（Relative substances），其种类和含量是反映药物安全性和纯度的直接指标[10]。欧洲药典为例[11]规定了16种相关物作为克拉霉素质量控制的对象，其中3-O-去克拉定糖-6-O-甲基红霉素A (I)，红霉素A 9-肟 (J)，3’-N-去甲基-6-O-甲基红霉素A(E)9-肟 (M)，6-O-甲基红霉素A(E)9-肟(C) 和3’-N-去甲基-6-O-甲基红霉素A (D)等5种相关物（结构见图1）均是生产过程中常见的中间体和降解产物，在我国生产的克拉霉素中较为常见，应该成为我国药典标准克拉霉素质量控制的重要指标。

在克拉霉素药品质量控制标准中，欧洲药典和美国药典[12]采用梯度洗脱的高效液相色谱法对克拉霉素进行分析检测，并对相关物的种类和各相关物的含量加以控制；中国药典2015版[13]仅要求控制单个杂质峰含量和杂质总量，而对相关物的种类和各相关物含量没有要求。我国药典与欧美药典的质量控制的差距不利于我国克拉霉素产品走向国际市场，且国内用药安全也不能得到保证。这是由于我国还不能提供在克拉霉素产品质量控制中需要的相关物。报道中[14]，从欧洲药典委员会购买的克拉霉素对照品按照欧洲药典的方法进行检测，但此对照品中不含有J、M、N和K等4种相关物。从欧洲药典委员会购买标准对照品价格非常昂贵，难以实现各质量控制部门均得到此标准对照品。本研究将I、J、M、C和D等5种相关物与克拉霉素的混合样品采用高效液相色谱法进行检测，并对分析检测方法进行了研究。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

HPLC体系由溶剂输送泵（LC-10AT，岛津公司）、柱温箱（CTO-10AS，岛津公司）和紫外检测器（SPD-10A，岛津公司）组成；色谱柱为Purospher STAR LP RP-18e(250mm×4.6mm，5um，德国默克公司)型C18柱。

克拉霉素相关物对照品由中国食品药品检定研究院提供；I（92.75%）， J（94.86%）， M（95.78%）， C（96.86%），D（97.33%）和克拉霉素（92.37%）对照品均为本课题组合成并且已经过已通过1H-NMR、13C-NMR和MS验证；HPLC所用的甲醇和乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件

流动相采用0.067mol/L KH2PO4溶液（pH 4.0）/乙腈=64/36；流速为0.7 ml/min；柱温为35℃；检测波长选用210nm；进样量为20ul。

1.3 溶液配制

克拉霉素相关物储备液：准确称取克拉霉素相关物对照品50.0mg，用流动相溶解并定容至5ml，于4℃冰箱中保存。

克拉霉素相关物标准溶液：移取克拉霉素相关物储备液1.5ml，用流动相稀释定容至5ml，室温避光放置。

线性试验系列溶液：准确称取I、J、M、C和D各2.0mg混合后以流动相溶解并定容至10ml，再依次稀释为各相关物浓度均为160, 120, 80, 40和20ug/ml的系列溶液，室温避光放置。

2 结果与讨论

2.1 5种克拉霉素相关物杂质分析条件研究

2.1.1样品溶剂的影响

样品溶剂对色谱峰的峰形有一定影响。本实验选取了乙腈、甲醇和流动相作为溶剂对克拉霉素相关物样品进行溶解后进样洗脱，所得分离结果如图2所示。结果表明在以乙腈为溶剂时，各相关物峰出现前沿现象，这可能是由于乙腈的非极性对于样品的溶解度强于流动相，当进样溶剂与流动相混合时，一部分分子会先与流动相混合，致使这些分子通过色谱柱的速度发生变化，使峰形扭曲，发生变形；以甲醇和流动相未溶剂时各组分峰形良好，但以甲醇为溶剂时谱图中会出现较多的杂峰对实验结果造成干扰，因此本研究选择流动相为溶剂对样品进行溶解和稀释。

2.1.2方法适应性研究

采用1.2项的色谱条件对克拉霉素相关物标准溶液进行检测，各相关物与克拉霉素都能够完全分离，（色谱图如图3所示）；相关物D的峰高与D和克拉霉素峰之间的峰谷到基线的高度之比大于3，符合系统适用性的要求。在此色谱条件下，I、J、M、C和D的相对保留时间（克拉霉素的保留时间为14.6min）分别为0.41min、0.55min、0.75min、0.84min和0.92min；各组分能够完全分离，分离度均大于1.0。

2.2 分析方法的验证

2.2.1精密度试验

取克拉霉素相关物标准溶液按照1.2项的色谱条件进行洗脱，重复进样6次并记录各相关物峰面积。计算得I、J、M、C、D和克拉霉素的RSD分别为1.86%、0.48%、1.84%、0.97%、0.94和1.00%，均小于2.0%，符合精密度要求。

2.2.2稳定性试验

取克拉霉素相关物对照品15.0mg，以流动相溶解并定容至5ml，混匀后室温避光放置。按照1.2的色谱条件于0、2、4、6和8h分别进样洗脱并记录各物质的峰面积。计算所得I、J、M、C、D和克拉霉素的RSD分别为1.09%、1.52%、1.95%、1.63%、1.20和1.21%，均小于2.0%，表明在室温避光的条件下放置时克拉霉素相关物标准溶液在8h内稳定。

2.2.3线性关系

将线性试验系列溶液分别按照1.2项的色谱条件进行洗脱并记录各相关物峰面积。以各相关物浓度（ug/ml）为x，峰面积为y计算回归方程和相关系数（如表1所示），结果表明在20～200ug/ml范围内，各相关物浓度与峰面积的相关系数均大于0.999，呈现良好的线性关系。

2.2.4准确度试验

加标回收率的测定是常用的确定准确度的方法之一，也是在样品测定时质量控制的主要方法。以克拉霉素为空白基质分别加入5种相关物，使每种相关物终浓度均为60、120、180ug/ml三个水平并按照1.2项的色谱条件进行洗脱，每个浓度重复进样3次，分别记录5种相关物的峰面积并计算回收率和精密度（见表2）。所得的各浓度条件下每种相关物的平均回收率均在102.13～110.39%之间，精密度均小于1.82%。

3 结论

本研究将采用高效液相色谱法对克拉霉素相关物对照品进行了分离，采用0.067mol/L KH2PO4溶液（pH4.0）/乙腈=64/36为流动相、流速0.7ml/min检测波长210nm、温度35℃的色谱条件，以等度洗脱的方式在25min内能够完全分离混合物中的各物质，简化了分析方法，降低了分析设备的要求。该方法的精密度试验中各组分峰峰面积的RSD均小于1.86%、稳定性试验中各组分峰峰面积的RSD均小于1.95%；各相关物在20～200ug/ml的浓度范围内线性关系良好（r＞0.999），平均回收率在102.13 ～110.39%范围内，所得结果均符合方法学的标准。此方法简便高效，可用于克拉霉素中I、J、M、C和D五种相关物的同时分离和检测，能够为克拉霉素产品的质量控制提供一定的技术支持。

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