副猪嗜血杆菌研究进展

方 勤,傅胜才

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙410128；2.湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙410131）

副猪嗜血杆菌是一种能引起浆液性纤维素性胸膜炎、心包炎及脑膜炎的兼性厌氧的革兰氏阴性菌，该病症是由Glasser于1910年进行了描述，所以称该病为Glasser病，但该菌直到1922年才由Schermer和Ehrlich分离出来，它与猪嗜血杆菌极为相似，在生长时都需要V因子（NAD），但Biberstein和White在1969年的研究表明其不需要X因子，所以按照国际命名惯例，使用“para-”前缀将其命名为“副猪嗜血杆菌”（Haemophilusparasuis，HPS)。HPS的研究已有百年的历史，其血清型目前已达15种，尚有一些不能分型，而且比例正在逐年增加，为了加强对其研究，新的方法已经变得越来越迫切。经过科学前辈们的研究，基因分型已经变得更加普遍和实用，但其基因型众多远远超过血清型，而且没有统一的图谱，也证明这项技术尚未成熟。HPS较难分离，因为其需要较高的营养环境以及在外界环境下极易死亡（通常需在12小时以内进行病原分离），另一方面抗生素的使用，其分离率变得更低。HPS的培养基主要有TSA（固）、TSB（液）、巧克力琼脂培养基（固），而且需要加入一定浓度的NAD才能正常生长。HPS的鉴定方法主要有生理特性鉴定、生化鉴定和PCR鉴定。抗体水平检测以间接-ELISA最为常见，而且包被的抗原有多种选择，如荚膜多糖、OMP5、HPS全菌体等。HPS疫苗多种多样，包括灭活苗、活疫苗、亚单位疫苗、菌影疫苗等，以制作方法、经济效益、安全程度等多方面考虑，通常首选灭活疫苗。在此，对HPS研究进展综述如下。

1 病原学研究进展

1.1 病原形态与培养特性

HPS在加入NAD的巧克力平板上为光滑的灰白色小菌落，经过革兰氏染色在光学显微镜下观察为革兰氏阴性菌，培养20～28h，呈现短杆状、球状、球杆状等多种形态，其中以短杆状为主；培养72h后分离菌出现杆状或者长丝状，且以长丝状较多。从健康猪上呼吸道分离到的HPS大多数有荚膜，而其他部位分离到的菌株多数无荚膜，通过活体传代可以筛选有荚膜的HPS，但是在培养基上多次传代有荚膜细菌的数量就会减少甚至没有。HPS的外膜蛋白（OMP）共有8种[1]，而且与HPS的毒力有关[2～3]。在培养基的筛选方面陈勇等[4]的研究结果证明HPS在加入NAD的TSA、TSB和巧克力琼脂培养基上生长良好，在LB、不含NAD的TSA、鲜血琼脂培养基、营养肉汤、马丁肉汤不生长，以NAD浓度大于0.08g/L的巧克力培养基上生长最好。

1.2 血清学研究

1952年Bakos描述4种HPS的血清型被命名为A-D血清型。随后Morozumi和Nicolet于1986年将其血清型增加到7个，Kielstein于1991年又增加了另外 6个 Jena血清型，Kielstein和Rapp-Gabrielson于1992年再次验证增加5个ND血清型。基于特定的兔抗血清免疫扩散试验(ID），Kielstein和Rapp-Gabrielson于1992年建议将HPS重新命名且分类。将1952年至1986年检测到血清型命名为1～7型，Jena血清型和ND血清型在统一血清型之后被命名为8～15血清型，之后这个分类原则被世界广泛接受，HPS被定义为15个血清型[5]，但是大约20%的分离株血清型不可定[6]。近年来，越来越多的临床菌株已不能按照琼脂扩散实验进行血清学分型，而且不可分型菌株的比例上升到41%[7]。而且经过临床实验王兴美等[8]证实在血清型中以1、5、10、12、13、14型具有强毒力，可致死患猪；2、4、15型具有中等毒力，不能致死但影响生长；3、6、7、8、9、11型毒力最弱，临床特征表现不明显。

1.3 基因型研究

基因分型的方法很多，包括蛋白多态性图谱分型法、限制性核酸内切酶指纹图谱分型法、PCR分型法。蛋白多态性图谱分型法又包括多位点酶电泳图谱分型法和外膜蛋白指纹图谱分型法，PCR分型法包括Rep-PCR技术分型法和PCR-RFLP分型法[9]。

多位点酶电泳图谱分型法是用通过用淀粉凝胶水平电泳分析多种酶的多态性获得电泳图谱，Blackall等[10]在1997用该方法研究40个澳大利亚HPS分离株和8个标准株（1、2、3、4、8、9型及2个5型）获得A、B两类一共33种电泳图谱和一种单一条带(代表一个不同的种或亚种)。外膜蛋白指纹图谱分型法是用电泳的方法获得蛋白质图谱，Ruiz等[2]在2001年研究了HPS的OMP的基因型与菌株分离部位之间的关系时发现来自多发性关节炎的病猪的28个HPS分离株形成了A、B两类OMP电泳图谱，其电泳条带在相对分子质量为3.63×104～3.85×104的区间上；来自健康猪呼吸道的18个HPS分离株形成了C、D、E、F和G等5类OMP电泳图谱；来自肺炎病猪呼吸道的7个HPS分离株显示出A、B、H和I型等4种OMP电泳图谱。表明在相对分子质量为3.63×104～3.85×104的电泳条带的A、B两类OMP指纹图谱可能与HPS毒力有关。限制性核酸内切酶指纹图谱分型法是运用限制性核酸内切酶指纹技术获得指纹图谱，Smart等[11]在1988年运用该技术研究了HPS在SPF猪和饲养猪的定居和分布，检测了69个分离菌株，得到37个限制性核酸内切酶指纹图谱，其中24株有特异的限制性核酸内切酶指纹图谱，剩余45株形成13个有交叉的限制性核酸内切酶指纹图谱。Rep-PCR技术是一种以能与基因组重复序列互补的寡聚核苷酸为引物，扩增出与重复序列之间长度不等的DNA片段，再电泳分离其扩增产物，从而建立特定细菌的特异DNA指纹图谱，又因为单个菌株的变异与重复序列之间的距离有关，以重复序列为探针的基因组指纹还可以鉴定不同细菌及其变异。PCR-RFLP分型法是由Dela等[12]在2000年对猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)血清7型和HPS血清3型的tbpA基因序列分析的基础上，合成了1对特异引物，并用PCR技术扩增了15个HPS标准株的tbpA基因，再分别用限制性内切酶RsaI、TaqI和AvaI进行处理，结果限制性内切酶RsaI酶产生10种RFLP图谱，限制性内切酶TaqI产生5种RFLP图谱，限制性内切酶AvaI产生3种RFLP图谱。其中血清5、12、14和15型限制性内切酶图谱是一样的，综合AvaI、RsaI和TaqI的RFLP图谱，HPS的15种标准血清型形成12种标准RFLP型。

2 流行病学研究

HPS是猪的常驻菌，病原主要存在于上呼吸道，发病猪和隐性感染猪为本病的传染源，主要通过猪群间的直接接触和空气污染进行传播，营养不良、仔猪免疫缺乏、混群为其主要诱因，临床症状是仔猪被毛粗乱、咳嗽、呼吸困难和生长迟滞，剖检主要可见浆液性纤维素性胸膜炎、心包炎和多发性关节炎。在我国HPS以4型（24.2%）、5型（19.2%）和13型（12.5%）最为流行[13]。周斌等[14]在2008年从华东地区养猪厂送检的病猪中分离到13株HPS，属6个血清型，其中1型2株，4型4株，5型2株，12型2株，10型和13型各一株。陆国林等[15]在2010年从浙江省5个县分离到26株HPS，其中4型8株，5型6株，12型5株，13型2株，其余5株无法分型。刘辉等[16]在2011年检测HPS在陕西关中地区的感染状况，从陕西关中地区14个发生关节炎和浆膜炎的猪厂采集30份病料，通过分离得到5株HPS，并参考Redondo等[17]建立的针对HPStbpA基因的PCR-RFLP分型方法，采用3种限制性内切酶TaqI、AvaI、AfaI对5个分离菌进行了RFLP分析，得到4种图谱，其中一株与Redondo报道的血清13型标准菌株相同。

3 致病机理研究

HPS的毒力因子与外膜蛋白相关，其致病方法主要有两种途径，一种途径是HPS通过引起上呼吸道黏膜表面纤毛上皮损伤使得纤毛活动性降低以及鼻黏膜和支气管黏膜急性肿胀导致黏膜损伤，从而增加致病细菌入侵机会，导致发病。另一种是由Lichtensteiger等[18]在研究HPS的唾液酸酶时发现这种酶能与透酶和醛缩酶发生协同作用，从而夺取宿主细胞的碳水化合物使得机体营养方面的问题而增强细菌毒力；除此之外，唾液酸酶还可以通过清除与宿主细胞糖原结合的唾液酸，从而暴露出一些致病细菌定居或侵入宿主细胞所需要的受体，以及降低黏蛋白的黏性来干扰宿主的防御系统。

4 疫苗研究

HPS疫苗多种多样，包括灭活苗、活疫苗、亚单位疫苗、菌影疫苗等。灭活疫苗包括商品灭活苗和自家灭活苗。目前，市场上商业化的疫苗主要有3种：HPS灭活疫苗Z-1517株、HPS灭活疫苗SV-1株+SV-6株、HPS灭活疫苗4型MD0332株+5型SH0165株[19]。活疫苗是由一种能产生交叉免疫力的弱毒突变HPS菌株制得。2011年由Newport实验室研制出第一株商业化的HPS活疫苗—Parasail疫苗。试验结果证明，Parasail疫苗可对猪群提供异源血清型4、5和13型之间的交叉保护。亚单位疫苗是一种化学成分疫苗，由菌体抗原纯化而来，不存在活疫苗带来的安全问题。李建军等[20]在2012年对H.parasuis血清5型的tbpA蛋白做了免疫原性的分析，结果发现，体外表达的tbpA蛋白能使小鼠产生高效价的抗体，具有很好的免疫及反应原性，为亚单位疫苗的研制奠定了基础。菌影疫苗是近年来新发展的一种新型的无细胞浆和核酸的空细菌体疫苗，不仅免疫原性高，又兼具佐剂的作用[21～22]。胡明明等[23～24]在2011年以血清5型副猪嗜血杆菌为载体，成功制备了H.Parasui菌影，并进行了免疫效力评价。

5 防治研究

HPS的防治措施主要包括抗生素治疗和免疫接种。很多药敏试验表明HPS对头孢类药物、喹诺酮类药物及庆大霉素敏感，对复方磺胺类药物、大环内酯类抗生素及氯霉素敏感性不是很稳定，对四环素、氨苄青霉素具有耐药性，但现今大多数病猪都为混合感染，抗生素的治疗效果不是非常理想。免疫接种方面，目前商品灭活苗的保护效益相差极大，2013年张宁等[25]选取国外两个知名厂家生产的两种HPS灭活疫苗免疫差距较明显，这可能是由于HPS血清型较多，且毒力差异较大，疫苗株与致病株血清型不同而缺乏交叉保护力。在自家灭活苗的研制中，宋凤香等[26]在2010年从德州某大型猪厂分离到HPS，经血清学鉴定为我国流行的血清5型，并制备了抗原含量为8×108CFU/mL的HPS油乳剂灭活疫苗，应用于德州市5个规模化猪场，结果表明HPS发病率由未免疫时的10.9%下降至1.9%，且5个猪厂HPS的发病率均控制在2.5%以下，证明地方株制备疫苗对防治该病有很好的效果。当然也与免疫过程有关，2005年邓晓霞等[27]做了HPS灭活疫苗免疫效果观察，该试验将怀孕后期的母猪随机分为3组，分为母、仔组免疫组；仔猪免疫组；非免疫组。结果证明母、仔组免疫组成活率和增重率高于仔猪免疫组高于非免疫组。

（13-27 略，需要者可向作者索取）

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