豆豉纤溶酶的溶血栓作用研究

◎韩 岚

（呼和浩特职业学院 生物化学工程学院，内蒙古 呼和浩特 010051）

血栓栓塞性疾病对于人类的健康有很大的影响，严重时会威胁生命，且后遗症严重，是继癌症之后的第二大类疾病[1]。世界卫生组织的统计分析表明，全世界死于血栓栓塞性疾病的人数约为2 600万人/年，我国每年心血管疾病死亡者占因病死亡总人数的40.7%，这一比例远高于癌症，位于各类致死疾病的第一位[2]。

使用溶栓酶药物被认为是血栓性疾病最有效的治疗方法，如尿激酶、链激酶、水蛭素等，但这些药物都在不同程度上存在着缺点[3]：如分子量较大，不易吸收；半衰期短（仅有3～20 min）；出血性副作用大；成本高，价格昂贵；只能静脉给药，使用不便等，很难被大众所广泛接受。

豆 豉 纤 溶 酶（Douchi Fibrinolytic Enzyme，DFE），是继纳豆激酶（Nattokinase，NK）之后发现的又一种具有强烈溶解血栓纤维蛋白功能的丝氨酸蛋白酶。该酶是从我国的传统发酵食品——豆豉中分离出来的。2004年，彭勇等[4]测定了解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）DC-4产生的DFE基因全序列，1 149 bp的开放阅读框，编码382个氨基酸残基，其中包括77个氨基酸的前肽和275个氨基酸的成熟肽。SDS-PAGE和等电聚焦电泳测得该酶分子量为28 kD，pI=8.0。最适pH值为9.0，最适温度为48 ℃。DFE不仅可水解纤维蛋白，而且可水解许多人工合成的小分子四肽底物，尤其是枯草杆菌蛋白酶作用底物S-7388（Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA），苯甲基磺酰氟（PMSF）可完全抑制其溶纤维活性。这些结果表明，DFE属于枯草杆菌蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶，与来源于纳豆枯草芽孢杆菌的纳豆激酶同源性为86.1%。研究表明，DFE能直接作用于血栓交联纤维蛋白并将其水解，而对血浆纤维蛋白原不起作用，具有很好的溶栓活性（纯化后比酶活达4 664.0 U/mg）[5]。

近年来，我国研究者将豆豉纤溶酶基因分别在原核和真核表达系统中进行表达，得到了具有活性的DFE。Zhang 等[6]将解淀粉芽孢杆菌DC-4的豆豉纤溶酶基因在大肠杆菌BL-21中表达，纯化后比酶活可达4 597.0 U/mg，且证明DC-4菌株所产生的豆豉纤溶酶蛋白需要前肽才能进行正确的折叠。肖露 等[7]将解淀粉芽孢杆菌的豆豉纤溶酶基因的前肽及成熟肽序列与淀粉酶基因的启动子及信号肽融合，转化枯草杆菌，重组豆豉纤溶酶比酶活为5 918.7 U/mg。张仁怀 等[8]将含有和不含前肽的豆豉纤溶酶基因在毕赤酵母中分别进行表达研究，发现用甲醇诱导时，在含有前肽的豆豉纤溶酶基因转化的毕赤酵母工程菌的培养液中可检测到较强的溶栓酶活性。

目前，开发溶栓能力强、价格低、副作用小、易吸收以及体内半寿期长的新型溶栓酶药物是血栓性疾病治疗研究的热点。来源于传统发酵食品的豆豉纤溶酶，可口服给药，并且用于体内溶栓较为安全，有望被开发并研制成使用方便的新型口服溶栓药物，在治疗和预防血栓病方面有着很好的应用前景和广阔的市场[9]。

[1]孙月娥，王卫东，李超.不同溶栓酶的特点、作用与临床应用研究进展[J].中国中药杂志，2010，35（6）：794-798.

[2]桂清.血栓性疾病已成为威胁人类健康和生命的重要疾病[J].中华检验医学杂志，2004，8（27）：487.

[3]Nakajima N，Taya N，Sumi H. Potent fibrinolytic enzyme from the lysate of Katsuwonuspelamis digestive tract（Shiokara）：purification and characterization[J].Biosci Biotechnol Biochem，1993，57（9）：1604-1605.

[4]PengY，Yang X J，Xiao L，et al. Cloning and expression of a fibrinolytic enzyme （subtilisin DFE）gene from Bacillusamy loliquefaciens DC-4 inBacillus subtilis[J]. ResMicrobiol，2004，155（3）：167-173.

[5]Peng Y，Huang Q，Zhang R H，et al. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi，a traditional Chinese soybean food[J]. CompBiochemPhys B，2003，134（1）：45-52.

[6]Zhang R H，Xiao L，Peng Y，et al. Gene expression and characteristics of a novel fibrinolytic enzyme（subtilisin DFE） in Escherichina coli[J].LettApplMicrobiol，2005，41（2）：190-195.

[7]肖璐，张仁怀，张义正.豆豉溶栓酶工程茵的发酵条件及重组溶栓酶的分离纯化[J].食品与发酵工业，2005，31（1）：66-73.

[8]张仁怀，王海燕，谈宁馨，等.豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化[J].应用与环境生物学报，2005，11（5）：623-626.

[9]范晓丹，郭勇.豆豉纤溶酶——一种潜在的新型溶栓药物[J].生命的化学，2005，25（5）：427-429.