肉鸡鹦鹉热衣原体病原微生物的实验室分离鉴定

段延军 张小丽

(1甘肃农业大学动物医学院730070；2中农威特生物科技股份有限公司730000)

衣原体病是由衣原体（Chlamydia）引起畜禽、野生动物和人类发生感染以流产、肺炎、支气管炎、胃肠炎、结膜炎、关节炎、脑脊髓炎为主要病理特征的疾病。鹦鹉热衣原体病（AA Chlamydiosis，AC）是一种接触性传播的人兽共患。在自然条件下肉鸡可以感染本病，表现出沉郁、呼吸困难、食量下降，常呈恶病质状态，最终因衰竭而导致死亡，耐过的病鸡表现生长受阻[1]。本研究采集某肉鸡养殖场疑似鹦鹉热衣原体病的组织病料，进行病原微生物的分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 实验动物

病鸡：采集某养殖场肉鸡群；SPF鸡胚购自北京实验动物中心。

1.2 试剂

衣原体单克隆荧光抗体诊断试剂盒（军事医学科学院微生物检验研究中心）；

衣原体病间接血凝（IHI）诊断试剂盒（湖北畜牧兽医研究所）；

姬姆萨染液；碘染液。

1.3 方法

1.3.1 血清学检测

采取疑似鹦鹉热衣原体病肉鸡血清，使用衣原体病间接血凝试验诊断试剂盒操作说明书进行血清学试验，根据试剂盒提供的标准判断血凝反应程度。

1.3.2 样品采集

根据病鸡临床症状和病理变化，取病变严重的肺脏、肝脏、气管、肾脏、心脏等病料，分为两份，一份用于鸡胚接种，一份用于脏器压片和细菌培养。

1.3.3 脏器压片检查

取采集的病料组织作压片后使用姬姆萨染色，镜检，观察包涵体。

1.3.4 细菌培养

将采集的病料组织接种于普通琼脂、麦康凯琼脂和血液琼脂培养基中，置于37℃恒温箱培养24h，观察细菌生长情况，挑取疑似菌落，涂片染色镜检，生化鉴定。

1.3.5 SPF鸡胚接种和传代

无菌采集明显临床症状病鸡的肺脏组织，充分研磨后加入200ug/ml链霉素，50ug/ml庆大霉素，100ug/ml万古霉素，加入生理盐水制成20%混悬液，2000r/min离心10min，取上清接种于7日龄SPF鸡胚卵黄囊腔中，0.3ml/枚，37℃孵育，逐日观察鸡胚病变情况，弃去3d内发生死亡的鸡胚，取4-6d死亡的鸡胚卵黄囊，压片，用荧光抗体标记的抗衣原体单克隆抗体染色，镜检衣原体的包涵体。

将分离培养的卵黄囊膜做涂片，甲醇固定3min，碘染色溶液染色10min，水洗，吸干，油镜下观察结果。

2 结果

2.1 临床症状和病理剖检

病鸡多呈隐形经过，食欲减退，精神沉郁，渐进性消瘦，呼吸困难，频繁张嘴呼吸，喜蹲卧，眼脸肿胀，流泪，鼻孔内流出大量脓性或浆液性鼻液。剖检发现病变主要集中在肺脏、气囊、肝脏和肾脏上，重症者肺脏出现单侧或双侧纤维素性渗出物，肺边缘粘连，单侧或双侧气囊混浊，肝脏颜色变淡，偶尔发现坏死灶，后期出现肝周炎，气管喉头有大量粘液，肾脏肿大出血。

2.2 血清学检测

本次共采集疑似鹦鹉热衣原体病鸡血清81份，血清学调查结果显示，临床上15～20日龄的肉鸡最乙肝，死亡鸡群主要集中在30～39日龄，发病率30%左右，死亡率10%左右，病程长约14～20d。

2.3 肺脏压片检查

在荧光显微镜下课见与抗衣原体荧光单克隆抗体反应，观察到亮绿色衣原体包涵体。

2.4 细菌培养

在普通培养基上发现一些无色光滑、颗粒样菌落，麦康凯培养基上长出亮红色，向培养基内凹生长的菌落，经染色镜检和生化鉴定，生长出的菌落为大肠杆菌。

2.5 SPF鸡胚接种

盲传三代4～6d规律性死亡的鸡胚胚体充血、出血，鸡胚头、颈、背部出现明显的出血斑，卵黄膜变薄，尿囊液清澈，囊膜水肿，取鸡胚卵黄囊膜压片，经荧光抗体标记的抗衣原体单克隆抗体染色后再荧光显微镜下可以观察到亮绿色荧光圆形颗粒，可判断为衣原体感染阳性。

3 讨论

国外许多学者认为鸡对鹦鹉热衣原体具有一定的抵抗力，自然感染的鸡常呈隐形或一过性感染，很难分离到衣原体，而且血清学检测阳性率比较低，幼鸡急性感染后可能出现死亡。后来有学者报道，由于鸡衣原体IHI抗体应答发生比较迟，鸡衣原体实际感染率要远远高于血清学阳性检出率[2]。本研究对某肉鸡场疑似鹦鹉热衣原体病鸡血清进行检测发现该肉鸡场感染情况普遍发生，发病率在25～30%左右，死亡率在10%左右，调查结果与文献报道一致[3]。

在鸡胚接种过程中，不同来源和不同批次的SPF鸡胚对同一鹦鹉热衣原体的敏感性不同，引发鸡胚致死率也有差异。研究结果显示，该菌株在细菌培养基上不声张，使用姬姆萨和荧光标记抗衣原体单克隆抗体染色接种鸡胚卵黄囊膜，在荧光显微镜下可以看到衣原体颗粒。在本次菌株分离的过程中还分离到了大肠杆菌，因此在临床上诊断时要注意鹦鹉热衣原体和大肠杆菌病混合感染的情况，并注意做出鉴别诊断。

[1]唐国芳,陈丽丽,刘良专,等.鹦鹉热嗜衣原体禽鸟株的分离鉴定及小鼠呼吸道感染模型的建立[J].微生物学报,2010,50(12):1657-1663.

[2]石岩,何诚,朱虹,等.肉鸡鹦鹉热衣原体的分离和鉴定[J].中国比较医学杂志,2003,13(4):217-220.

[3]王争强,朱虹.鹦鹉热嗜衣原体检测和诊断方法研究进展[J].微生物学免疫学进展,2005,33(2):75-78.