D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯对抗P-糖蛋白介导的多药耐药研究进展

舒湘岑 ，陈 静(孝感市中心医院药学部，湖北 孝感 432000)

药物治疗引起的多药耐药(multiple drug resistance，MDR)是影响疗效的主要因素之一，而P-糖蛋白(P-glycoprotein，Pgp)过度表达是引起MDR 的常见原因，因此，抑制P-gp 介导的外排作用已成为国内外研究热点。早期的一些外排泵抑制剂如普罗帕酮、维拉帕米等会产生一些不可接受的不良反应，从而限制了临床应用。因此，寻找一些无毒、刺激性小、生物相容性好的逆转剂成为新的焦点。D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(D-tocopherol polyethylene glycol succinate，TPGS)已被美国食品药品监督管理局(food and drug administration，FDA)批准为可上市的多功能药物辅料，重要的是，其不仅能促进胞吞，许多研究还证实，其可以有效抑制P-gp 外排作用，从而达到逆转MDR，并且更加高效、安全。现结合文献将其在抑制P-gp 外排方面的研究现状综述如下。

1 肿瘤MDR 的形成原因

肿瘤MDR 是MDR 中的一种，是导致肿瘤化疗失败的主要原因之一。其是指当一种药物作用于肿瘤细胞使之产生耐药性后，对其他结构不同、作用靶点不同的抗肿瘤药物也具有交叉耐药的现象。肿瘤细胞的MDR 是由于细胞膜过度表达外排抗肿瘤药物的蛋白所致，如P-gp 的过度表达。当癌细胞与药物接触时药物与P-gp 结合，ATP 水解释放能量，P-gp 借助能量将底物逆浓度梯度泵到细胞外，最终使细胞内药物浓度不断下降，肿瘤细胞出现耐药效应［1］。因此，寻找能与P-gp 特异性结合的药物是逆转MDR 的重要方法。

2 P-gp 功能与逆转MDR 机制

P-gp 是一种相对分子质量为170 ×103的ATP 能量依赖型外排蛋白，又称为转运ATP 酶(traffic ATPase)［2］。1976 年Juliano 和Ling 首次在MDR 癌细胞系发现高表达的P-gp。随后，陆续发现P-gp 广泛表达于小肠上皮细胞，肾、血-脑脊液屏障等多种组织和器官中。P-gp 限制药物通过血脑屏障，并且阻止潜在毒性物质由小肠入血，因此，其在保护正常组织及维持正常生理功能方面具有重要作用［3-4］。逆转肿瘤MDR 机制有多种，如抑制P-gp 功能，ATP 水解与结合是P-gp 发挥作用的关键，可以干扰ATP 水解过程，阻滞P-gp 介导的药物逆流;也可以非竞争或竞争性阻滞P-gp 结合位点而抑制其功能;也可以通过改变细胞膜脂质完整性而发挥作用;还可以同时抑制P-gp的功能和表达。

3 TPGS 浓度对P-gp 抑制作用的影响

TPGS 是维生素E 的水溶性衍生物，具有刺激性小、毒性低、生物相容性好等优点，广泛应用于药剂学领域，可作为乳化剂、稳定剂、增溶剂或脂溶性药物传递系统的载体［5］，更重要的是，其具有抑制P-gp 外排功能，在抗肿瘤方面具有广阔的应用前景。

Dintaman 等［6］于1999 年最先研究了TPGS 与P-gp 的关系。以人结肠癌细胞系(human colon carcinoma cell line，Caco-2)作为模型，其有类似于小肠上皮的顶侧膜(A)和基底侧膜(B)，且能过度表达P-gp 等外排蛋白，以罗丹明123 为模型药物，其是一种由P-gp 介导外排的药物。结果发现，0.001 0% ～0.002 5%的TPGS 能减少罗丹明123 从Caco-2 细胞膜B-A 的外排，且随着TPGS 浓度的增加，外排抑制作用增强，若用人回盲肠腺癌细胞(HCT-8)代替Caco-2 细胞，也获得相似结果，从而证实TPGS 是一个有效的P-gp 抑制剂。

Collnot 等［7］同样以Caco-2 细胞系为模型进行研究发现，维生素E 琥珀酸酯、维生素E 及不同链长度的聚乙二醇均没有对P-gp 的抑制作用，但维生素E 琥珀酸酯与聚乙二醇形成的TPGS 能显著抑制罗丹明123 在Caco-2 细胞中的外排。同时研究表明，在低于TPGS 的临界胶束浓度(0.02 wt%)时，其可以抑制P-gp 的功能，从而抑制经P-gp 介导的药物转运和MDR，高于临界胶束浓度的条件下，抑制罗丹明123 在Caco-2细胞中的外排作用并不明显。这可能是因为TPGS 在临界胶束浓度以下以单聚体形式存在，单体能渗透进入细胞膜，一旦浓度高于临界胶束浓度则在溶液中形成胶束，一方面无法渗透进细胞膜抑制P-gp 的功能;另一方面将药物包裹起来，使游离药物量减少，进而阻碍了吸收［8-9］。

4 TPGS 理化性质对P-gp 抑制作用的影响

除TPGS 外，其他非离子表面活性剂，如吐温-80(Tween 80)、普朗尼克(Pluronic)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)等同样能抑制P-gp 的功能。有研究证实，TPGS 抑制效果最为明显，由大至小依次为TPGS、Pluronic PE8100、Cremophor EL、Pluronic PE6100［9］。在各种非离子表面活性剂中，TPGS 表现出较强的P-gp 抑制作用，可能与其理化性质有关。TPGS 既含有维生素E的亲脂基团，又含有聚乙二醇长链的亲水基团，是两亲性的非离子表面活性剂并且有良好的水溶性，室温时临界胶束浓度的质量分数约为0.02%(132 μM)，亲水亲油平衡值(hydrophilelipophile balance，HLB)约为13 ～17，其具有生育酚酯的结构，从而具有一定的抗氧化性。可能这些理化性质使其抑制P-gp 的外排作用更强，增加了药物的吸收，提高了生物利用度［10-11］。

5 TPGS 结构对P-gp 抑制作用的影响

Collnot 等［7］研究发现，TPGS 中聚乙二醇(polythylene glycol，PEG)链的长短与P-gp 抑制作用有关。通过实验证实，TPGS1000 是最有效的P-gp 外排抑制剂，其能有效抑制Caco-2细胞膜上的P-gp，减少罗丹明123 在B-A 方向的转运，但对AB 方向的转运无影响，能使底物罗丹明123 的吸收提高82%，外排降低77%，其抑制效率远大于不同PEG 链长的TPGS 同系物。这些同系物的实验结果是通过韦布尔分布(Weibull distribution)拟合发现的，PEG 链长在24 ～33 个链节、相对分子质量为1.1 ～1.5 ×103的TPGS 抑制活性最强。推测可能是PEG 链的长度影响了TPGS 的理化性质。

Wempe 等［12］对TPGS 同系物的亲水部分和亲脂部分分别进行了修饰，方法及结果如下:(1)亲水部分，如果将PEG 换成等链长的PEG-聚丙二醇(poly propylene glycol，PPG)共聚物，那么抑制活性提高到66%，而如果用等分子质量的PPG 完全替换PEG 链，则能达到最大的抑制活性(92%)。而仅仅修饰PEG 头部的基团，如接上一个油酸脂基团，则抑制活性不会增加。进一步实验结果显示，TPGS1000 与TPGS400 相比，在细胞穿透性试验中对P-gp 底物——罗丹明123 的外排抑制明显具有优势。(2)亲脂部分，用色原烷醇或胆固醇替换α-生育酚，对P-gp 的抑制作用分别从33%提高到了62%和59%。如果去掉中间连接部分的琥珀酸，抑制活性也提高到63%，若直接用去氧胆酸或胆酸作为亲脂部分，抑制活性提高到54%。有研究针对TPGS的衍生物，改变TPGS 疏水基团，用硫辛酸、叶绿醇、胆固醇代替原来结构中的维生素E，结果证明，这些衍生物对P-gp 的抑制能力与TPGS1000 相比有了明显变化。抑制作用由小至大依次为硫辛酸聚乙二醇1000 酯、叶绿醇聚乙二醇1000 琥珀酸酯、TPGS1000、胆固醇聚乙二醇1000 琥珀酸酯，其中胆固醇聚乙二醇1000 琥珀酸酯具有明显优势。表明表面活性剂亲水亲脂部分的改变对P-gp 的抑制效果具有决定性作用。

Zhao 等［13］合成了由PEG 和维生素D3组成的新型聚乙二醇维生素D3琥珀酸酯(cholecalciferol polyethylene glycol succinate，CPGS)。其与TPGS 有类似的化学结构及物理化学性质，Caco-2 细胞毒性实验结果表明，CPGS 可增加阿霉素细胞毒性，推测可能与CPGS 抑制了P-gp 的药泵作用有关。

6 TPGS 抑制P-gp 机制研究

Rege 等［14］研究了TPGS、Tween 80、Cremophor EL 等3 种非离子表面活性剂对Caco-2 细胞层上P-gp 的抑制作用，同时研究了细胞膜流动性在这个抑制过程中所起的作用。在罗丹明123 A-B 及从B-A 的双向渗透性实验中，Tween 80 和Cremophor EL 可显著增加A-B 渗透，而使B-A 渗透减少，显示二者均能明显增加细胞膜流动性，而TPGS 仅使罗丹明123 在Caco-2 细胞层B-A 的渗透减少，细胞膜流动性变化不是很明显。从分子层面进行分析显示，只有当TPGS1000 浓度超过有效抑制浓度100 倍时，细胞膜流动性才略升高，即完全抑制外排的浓度远小于使膜流动性改变的浓度［15］。TPGS 在抑制Pgp 过程中不会影响细胞膜流动性，也可以确定细胞膜流动性的改变不是抑制P-gp 外排作用的主要机制［16］。

Collnot 等［17］应用单克隆CD243 P-gp 抗体(UIC2)研究P-gp的构象转化，进而对P-gp ATP 酶抑制机制进行研究。加入TPGS 后UIC2 的结合只是轻微减少，其对UIC2 结合的降低显著弱于正钒酸盐，表明在P-gp 泵转运过程中TPGS 不是底物，并非通过抢占底物转运结合位点达到抑制作用，也不是竞争性抑制剂，不通过变构调节和空间位阻发挥抑制作用;P-gp 形态改变不是由于TPGS 直接作用于一个或两个P-gp ATP 核苷酸结合区域。加入TPGS 后通过对胞内ATP 的监测，排除了ATP 排空机制。事实上TPGS 抑制的是底物诱导的ATP 酶活性。表明ATP酶活性的抑制是影响P-gp 外排功能的一个重要因素。

7 TPGS 对CYP3A4 抑制作用的研究

CYP3A4 是药物Ⅰ相代谢的主要酶系，在肠道，其含量约占小肠CYP 总量的70%，位于人小肠的柱状上皮细胞;P-gp 位于成熟肠细胞尖端表面的刷状缘［18］。P-gp 的底物特异性很大程度上与CYP 相似，二者有很多重叠的底物，功能有协同作用，且已得到体内、外试验证实。机制是未被CYP3A4 代谢的药物分子被P-gp 泵到肠腔后，这些物质可重新被肠细胞吸收，而进一步被酶代谢，因而可再次暴露于CYP3A4，最终使药物分子接触代谢酶CYP3A4 的机会大大增加，促进了药物的肠道代谢，明显降低了底物药物的吸收。同时，CYP3A4 代谢产物可能是P-gp 药泵的底物，从而在肠道吸收过程中更难于透膜吸收，降低了药物生物利用度。由此可以推测，TPGS 对CYP3A 也具有抑制作用［19］。

Johnson 等［11］研究表明，体外TPGS 能抑制CYP3A，其抑制作用强于酮康唑，在体内，如果TPGS 与CYP 的底物合用时，可改变底物药物动力学。也有研究采用小鼠肠腔组织作为模型研究TPGS 对CYP3A 的底物——维拉帕米代谢的影响。结果显示，TPGS 在浓度为0.01% 时能显著抑制代谢酶——CYP3A 的活性［20］。

8 TPGS 在抗癌药物中抑制P-gp 的研究

TPGS 类似物因能形成胶束并可抑制P-gp 外排作用而被广泛应用于疏水性抗癌药物中［21-24］。Varma 等［25］在紫杉醇乙醇溶液中分别添加Cremophor EL 和TPGS400，考察口服紫杉醇的绝对生物利用度，结果后者是前者的3.1 倍，因为TPGS 既可增加紫杉醇的溶解度，又能抑制P-gp，从而提高了紫杉醇的肠通透性。加入TPGS 后紫杉醇溶解度明显提高，当其质量浓度＞0.1 mg/ml时溶解度随其含量增加呈线性增加，当TPGS 质量浓度达到0.1 mg/ml 时能最大限度地提高了紫杉醇渗透性，有最大限度地抑制P-gp 外排活性，进一步增加TPGS 质量浓度，A-B的渗透性降低，而从B-A 的渗透性不变。紫杉醇在大鼠回肠呈不对称吸收，B-A 的吸收是A-B 的26 倍，加入维拉帕米(P-gp 抑制剂)后这种不对称转运有所减弱，充分证明紫杉醇是P-gp 外排作用的底物，且TPGS 确实可抑制P-gp 外排。另外，体内药动学实验显示，同时服用紫杉醇(25 mg/kg)和TPGS(50 mg/kg)后紫杉醇生物利用度能提高6.3 倍，而同样条件下，维拉帕米对其生物利用度的提高仅为4.2 倍。

Dintaman 等［6］使用NIH3T3 细胞和人类MDRIcDNA 转染的NIH3T3 细胞(G185)对紫杉醇、阿霉素、长春花碱、秋水仙碱和氟尿嘧啶的细胞毒性进行考察，NIH3T3 细胞上没有P-gp，而G185 细胞上有，故G185 细胞抵抗紫杉醇、阿霉素、长春花碱、秋水仙碱细胞毒性是NIH3T3 细胞的27 ～135 倍，加入TPGS后可明显提高这些药物对G185 细胞的细胞毒性。然而，实验结果显示，加入TPGS 后氟尿嘧啶对G185 细胞和NIH3T3 细胞有等效的毒性，并没有提高氟尿嘧啶对G185 细胞的细胞毒性，这是因为氟尿嘧啶不是P-gp 的底物［26］。

在医药领域，TPGS 是一种无毒、生物相容性好的多功能药物辅料，已被FDA 批准为安全、有效的药用辅料，且被收入美国药典。在抗肿瘤方面，以其为辅料可抑制P-gp，从而提高药物对肿瘤细胞的杀伤力，增加药物的口服生物利用度。目前，TPGS作为P-gp 抑制剂的研究，已取得较好的效果，但其精确机制尚需进一步探讨，其可与一些抗肿瘤药合用，发挥协同疗效。随着对TPGS 性质的不断研究和P-gp 泵药机制的深入了解，TPGS 作为肿瘤MDR 逆转剂应用于临床抗肿瘤治疗具有极大的潜质。

［1］ Abu Ajaj K，Kratz F. Development of dual-acting prodrugs for circumventing multidrug resistance［J］. Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters，2009，19(3):995.

［2］ 朱宝英，黄静，王永林，等. P-糖蛋白及肿瘤多药耐药的逆转［J］.中国药房，2011，22(6):550-551.

［3］ 闻镍，张双庆，朱凌，等. P-糖蛋白最新研究进展［J］. 中国药事，2011，25(7):718-723.

［4］ 胡大裕，李高，陈鹰.表面活性剂对肿瘤细胞多药耐药逆转作用的体外筛选［J］.中国药师，2009，9(5):390-393.

［5］ 顾晓华，王轩，安磊，等.齐墩果酸/PLGA-TPGS 纳米粒的制备及其体外释放行为研究［J］.中国药房，2012，23(29):2726-2728.

［6］ Dintaman JM，Silverman JA. Inhibition of P-glycoprotein by D—tocopherol polyethylene glycol succinate 1000(TPGS)［J］. Pharma Res，2009，16(10):1550.

［7］ Collnot EM，Baldes C，Wempe MF，et al. Influence of Vitamin E TPGS poly (ethylene glycol)chain length on apical efflux transporters in Caco-2 cell monolayers［J］. J Controlled Rel，2009，111(1/2):35.

［8］ Akhtar N，Ahad A，Khar RK，et al. The emerging role of Pglycoprotein inhibitors in drug delivery:a patent review［J］.Expert Opin Ther Patents，2011，21(4):561.

［9］ Lo YI. Relationships between the hydrophilic-lipophilic balance values of pharmaceutical excipients and their multidrug resistance modulating effect in Caco-2 cells and rat intestines［J］.J Controlled Rel，2009，90(1):37.

［10］ Bowman K，Erne-Brand F，Alsenz J，et al. The role of surfactants in the reversal of active transport mediated by multidrug resistance proteins［J］.Pharm Sci，2009，92(6):1250.

［11］ Johnson BM，Charman WN，Porter CJ. An in vitro examination of the impact of polyethylene glycol 400，Pluronic P85，and vitamin E d-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate on Pglycoprotein efflux and enterocyte-based metabolism in excised rat intestine［J］.AAPS PharmSci，2012，4(4):E40.

［12］ Wempe MF，Wright C，Little JL，et al. Inhibiting efflux with novel nonionic surfactants:Rational design based on vitamin E TPGS［J］.Int J Pharm，2009，370(1/2):93.

［13］ Zhao HZ，Tan EC，Yung LY. Potential use of cholecalciferol polyethylene glycol succinate as a novel pharmaceutical additive［J］.J Biomed Mater Res A，2009，84A:954.

［14］ Rege BD，Kao JPY，Polli JE. Effects of nonionic surfactants on membrane transporters in Caco-2 cell monolayers［J］. Eur J Pharm Sci，2002，16(4):237-246.

［15］ Collnot EM，Baldes C，Wempe MF，et al.Mechanism of inhibition of P-glycoprotein mediated efflux by Vitamin E TPGS:influence on ATPase activity and membrane fluidity［J］. Mol Pharm，2009，4(3):465.

［16］ Yamagata T，Kusuhara H，Morishita M，et al. Effect of excipients on breast cancer resistance protein substrate uptake activity［J］. J Controlled Rel，2009，124(1/2):1.

［17］ Collnot EM，Baldes C，Schaefer UF，et al. Vitamin E TPGS Pglycoprotein inhibition mechanism:influence on conformational flexibility，intracellular ATP levels，and role of time and site of access［J］.Mol Pharm，2010，7(3):642.

［18］ 陈欣，李玉珍，方翼.CYP3A4 代谢药物的特点及其多态性的研究现状［J］.中国药房，2010，21(22):2097.

［19］ 吴丽花，马萌.肠壁CYP3A4 和P-糖蛋白与口服药物生物利用度［J］.中国药房，2003，14(7):437.

［20］ Mudra DR，Borchardt RT. Absorption barriers in the rat intestinal mucosa.3:effects of polyethoxylated solubilizing agents on drug permeation and metabolism［J］.Pharm Sci，2010，99(2):1016.

［21］ Xiao L，Xiong X，Sun X，et al. Role of cellular uptake in the reversal of multidrug resistance by PEG-b-PLA polymeric micelles［J］.Biomaterials，2011，32(8):5148-5157.

［22］ Mi Y，Liu Y，Feng S-S. Formulation of docetaxel by folic acidconjugated D-atocopheryl polyethylene glycol succinate 2000(vitamin E TPGS2k )micelles for targeted and synergistic chemotherapy［J］.Biomaterials，2011，32(16):4058-66.

［23］ Huijun Zhu，Hongbo Chen，Xiaowei Zeng，et al. Co-delivery of chemotherapeutic drugs with vitamin E TPGS by porous PLGA nanoparticles for enhanced chemotherapy against multi-drug resistance［J］.Biomaterials，2014，35(7):2391-2400.

［24］ Zhao HZ，Yung LYL. Addition of TPGS to folate-conjugated polymer micelles for selective tumor targeting［J］. J Biomed Mater Res A，2009，91(2):505-18.

［25］ Varma MV，Panchagnula R. Enhanced oral paclitaxel absorption with vitamin E-TPGS:effect on solubility and permeability in vitro，in situ and in vivo［J］.Eur J Pharm Sci，2013，25(4-5):445.

［26］ T Traber，M. G.，Kayden，H. J.，Green，J. B.，Green，M. H.Absorption of water-miscible forms of Vitamin E in a patient with cholestasis and in choracic duct cannulated rats. Am［J］. J Clin Nutr，2012，44(6):914.