鱼藤酮建立帕金森病细胞模型的方法研究

陈春暖 陈祥荣 蔡若蔚 曹学兵 王涛

帕金森病（Parkinson disease，PD）是中老年人群中常见的一种神经变性疾病，其最重要的病理变化是黑质多巴胺能神经元选择性缺失和残存神经元中出现以α－突触核蛋白（α－synuclein）为主要成分的路易小体和路易轴突。目前认为其发生是遗传变异、环境暴露以及年龄等多个因素相互作用的结果，其发病机制目前还不明确。为深入研究PD发病机制，建立一个好的模型至关重要，一方面可以模拟疾病发生的病理生理过程，另一方面还能验证疾病的发病原因。流行病学、生物化学及动物模型研究均显示，鱼藤酮能更好地模拟PD发生［1－2］。鱼藤酮通过抑制线粒体复合物Ⅰ活性的作用，抑制线粒体呼吸链对氧的利用，使细胞缺氧而发挥毒性作用［3］。人神经母细胞瘤细胞SH－SY5Y细胞系具有多巴胺能神经元的许多特征，目前被广泛用作PD研究的多巴胺能神经细胞模型。因此，本研究选择鱼藤酮作为神经毒素处理SH－SY5Y细胞建立PD细胞模型，为进一步探讨线粒体功能障碍导致PD发病的分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 SH－SY5Y细胞购自武汉大学典型培养物储藏中心；DMEM／F12培养基购自Gibco公司；鱼藤酮、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基耦氮唑盐（MTT）、多聚甲醛、硫磺素S（Thioflavin S）为美国Sigma公司产品；胎牛血清购自美国Hyclone公司；牛血清白蛋白（BSA）、Triton－X－100均为 Amresco公司产品；兔抗α－synuclein购自美国SAB公司，鼠抗β－actin购自武汉三鹰公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗，罗丹明标记羊抗兔二抗购自美国Pierce公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、苏木精、伊红等购自碧云天公司；SDS－PAGE制胶试剂盒购自谷歌生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：SH－SY5Y 细胞置于 DMEM／F12培养基〔其内含10%（体积分数）灭活胎牛血清，青霉素、链霉素终浓度均为100U／L〕中，于5%（体积分数）CO2、37℃培养箱内进行培养，每2 d换液，细胞达70%～80%融合时传代，进行后续实验研究。

1.2.2 细胞形态观察和MTT法检测细胞活力：细胞培养后传代（2～3代），调节SH－SY5Y细胞密度，以每孔103～104个细胞接种于96孔板中，每孔体积200μL。实验设空白对照组（仅培养基，无药物）和鱼藤酮0.5μmol／L、1.0μmol／L、2.5 μmol／L、5.0μmol／L组五组。结合课题组前期实验结果及国内外文献，浓度低于0.4%（体积分数）的 DMSO对细胞无显著影响［3－4］，鱼藤酮用 DMSO溶解，使DMSO在细胞培养液终浓度小于0.4%（体积分数）而未设溶剂对照组。细胞贴壁生长后，分别加入鱼藤酮使终浓度为 0.5μmol／L、1.0 μmol／L、2.5μmol／L、5.0μmol／L培养，每组设5个复孔，24h和48h时于200倍倒置显微镜下观察细胞形态变化和贴壁能力。观察形态之后，每孔加入 MTT溶液（5mg／mL）20μL，继续培养4～6 h，弃培养基，每孔加入DMSO 150μL，振荡10 min，使甲臜充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定每孔570nm波长处的吸光度〔D（λ）〕值，计算细胞存活率。细胞存活率＝药物组D（λ）值／空白对照组D（λ）值×100%。

1.2.3 Western blot法检测细胞α－synuclein表达：实验分为空白对照组和鱼藤酮0.5μmol／L、1.0μmol／L、2.5μmol／L、5.0μmol／L组五组。细胞于5mL培养瓶中传代培养，待细胞长满70%～80%后，更换为含有上述相应终浓度鱼藤酮的培养基继续培养24h后，用RIPA裂解液分别提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，按体积1∶5比例加入5×Loading Buffer，95℃变性5min。SDS－PAGE制胶，上样及电泳，转膜，50g／L脱脂奶粉封闭1～2h。封膜，加入一抗工作液（兔抗αsynuclein：1∶200；鼠抗β－actin：1∶4000）4℃过夜。TBST洗膜加入二抗工作液（1∶5 000～1∶10 000），洗膜后ECL曝光、显影。根据蛋白相对分子质量（Mr：α－synuclein 为 19 000，β－actin 为43 000）确定目的条带位置，用图像灰度分析软件分析条带的灰度值。以β－actin为内参蛋白，将两者灰度值比（α－synuclein／β－actin）作为α－synuclein的相对表达量，以空白对照组相对表达量为1，计算各鱼藤酮组α－synuclein相对表达量。

1.2.4 HE染色观察细胞内包涵体的形成：实验分为空白对照组及鱼藤酮0.5μmol／L、1.0μmol／L组，每组设24h、48h两个亚组。将玻片置入6孔板中，取培养瓶中培养好的生长融合至瓶底70%～80%的细胞进行传代3代，并调整SHSY5Y细胞密度约2×105／mL，取100μL接种于6孔板中进行细胞爬片，再加入培养基至总体积2 mL，待细胞长满玻片的70%左右，更换为含有相应浓度鱼藤酮的培养基，分别培养至24h和48h行HE染色，200倍光镜下观察各组细胞内嗜伊红染色包涵体形成情况。

1.2.5 激光共聚焦免疫荧光双标法检测α－synuclein分布变化：结合MTT结果和HE染色观察结果，选取1.0μmol／L鱼藤酮培养24h（鱼藤酮组）进行本实验，另设空白对照组。两组均行细胞爬片，鱼藤酮组待细胞长满玻片的70%左右给细胞换培养液，更换为含有1.0μmol／L鱼藤酮的培养液继续培养24h，两组细胞均予4%（40g／L）多聚甲醛固定经Triton－X－100破膜，小牛血清封闭，加入兔抗α－synuclein抗体（1∶100）4℃过夜，再加罗丹明标记的羊抗兔二抗（1∶100）孵育1h，漂洗后加入Thioflavin S溶液染色，充分漂洗后在400倍激光共聚焦显微镜下观察α－synuclein分布变化及聚集体形成。α－synuclein经染色后在激光显微镜下呈红色荧光，淀粉样结构经Thioflavin S染色后呈现绿色荧光，共聚焦后呈黄色荧光为两者共同染色，于激光共聚焦显微镜下观察是否有两者共染色阳性聚集体形成。

上述实验均至少重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。数据均符合正态性分布，用均数±标准差表示。各组间细胞存活率及α－synuclein相对表达量比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组SH－SY5Y细胞形态学改变 空白对照组24h和48h时均可见SH－SY5Y细胞生长较密，神经突起明显且细长，轻摇晃培养基细胞不易脱落，细胞贴壁生长。在24h时，鱼藤酮0.5 μmol／L组细胞突起减少；鱼藤酮1.0μmol／L组细胞突起减少较0.5μmol／L组稍明显并皱缩；鱼藤酮2.5μmol／L组细胞体肿胀明显，胞体稍肿胀；鱼藤酮5.0μmol／L组细胞突起减少更明显，圆缩细胞增多；48h与相应浓度24h组比较，鱼藤酮各组细胞突起减少及细胞肿胀、皱缩更明显，漂浮细胞增多（图1）。

2.2 鱼藤酮对细胞活性的影响 鱼藤酮0.5 μmol／L、1.0μmol／L、2.5μmol／L和5.0μmol／L组24h时细胞存活率分别为（90.76±11.60）%、（86.06±9.06）%、（83.38±10.06）%和（80.06±11.39）%，48h时细胞存活率分别为（62.06±7.13）%、（60.88±8.50）%、（56.22±6.69）%和（50.26±6.94）%。除0.5μmol／L鱼藤酮组24h外，其余各鱼藤酮组细胞存活率与空白对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 细胞内α－synuclein表达 鱼藤酮0.5、1.0、2.5和5.0μmol／L 组 SH－SY5Y 细胞内 α－synuclein相对表达水平分别为1.23±0.11、1.41±0.20、1.77±0.09和1.31±0.28，其中1.0μmol／L、2.5μmol／L鱼藤酮组α－synuclein相对表达水平与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图1 不同浓度鱼藤酮培养SH－SY5Y细胞形态表现（倒置显微镜×200）

2.4 各组细胞包涵体形成观察 光镜下可见，24 h和48h时空白对照组细胞突起细长且明显，胞核呈嗜碱性，胞质内未观察到嗜酸性包涵体形成；鱼藤酮0.5μmol／L组24h时细胞形态改变不明显，未观察到包涵体形成；鱼藤酮1.0μmol／L组24h和鱼藤酮0.5μmol／L组48h胞质内出现边界清楚的嗜伊红的类路易小体样包涵体（如箭头所示），细胞突起较少，胞体和胞核增大，胞质疏松；鱼藤酮1.0μmol／L组4 8h时细胞体肿胀，胞质疏松、空泡化，部分胞体变圆，核固缩的细胞明显增加，未观察到包涵体形成（图3）。

图2 不同浓度鱼藤酮培养SH－SY5Y细胞中α－synuclein表达（Western blot法）

图3 不同浓度鱼藤酮培养SH－SY5Y细胞形态及包涵体形成情况（HE×400）：图中箭头所示为胞质内包涵体

2.5 鱼藤酮组α－synuclein的分布 在激光共聚焦显微镜下，鱼藤酮1.0μmol／L组24h时SHSY5Y细胞中可见颗粒状α－synuclein免疫染色（红色荧光）阳性聚集物（白色箭头所示），可被Thioflavin S（绿色荧光）共定位，提示这类聚集物含有β－淀粉样结构；空白对照组细胞可见α－synuclein均匀分布在整个细胞内，呈均一染色的红色荧光（图4）。

3 讨论

PD是由多种病因导致的复杂疾病，其发病机制目前尚未完全明确。为更好地研究PD发病机制，研究者不断改进其细胞和动物模型。目前常用的PD造模工具药有1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氢吡啶（1－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahydropyridine，MPTP）、6－羟多巴胺（6－hydroxydopamine，6－OHDA）及鱼藤酮［2］。在PD发病的众多学说中，目前证据显示线粒体复合物Ⅰ抑制是PD发病的核心机制之一，干扰复合物Ⅰ活性可以导致α－synuclein聚集［1，5］。鱼藤酮作为杀虫剂和鱼塘清理剂，是一种广泛存在于自然界的环境毒素，与人们的生活密切相关且易于接触。它正是通过抑制线粒体复合物Ⅰ活性的作用，抑制线粒体呼吸链对氧的利用而发挥毒性作用。鱼藤酮作为目前新型的造模工具药受到广泛关注［2］。鱼藤酮在其诱导的PD动物模型中，能选择性地引起黑质纹状体多巴胺能神经元变性，使黑质神经元胞浆中出现泛素和α－synuclein阳性的包涵体，在解剖学、神经化学、行为学和神经病理特征等方面更好地模仿PD发病机制［1］。因此，本实验选取鱼藤酮作为神经毒素诱导多巴胺能神经元SH－SY5Y细胞建立PD细胞模型。

图4 鱼藤酮对细胞内α－synuclein的分布改变（免疫荧光×400）：图中箭头所示绿色荧光为Thioflavin S染色阳性聚集体，红色荧光为α－synuclein染色阳性聚集体，黄色荧光为两者共染色阳性聚集体

常用的PD急性模型由于毒物使用剂量大，往往作用很短时间如数分钟或数小时就造成细胞大量死亡［6－7］。然而，在自然环境中人们很难接触到如此高浓度的鱼藤酮，且作用时间过短，与PD的慢性病程不相符，因此慢性细胞模型更具现实意义。Sherer等［8］用较低浓度鱼藤酮（5.0nmol／L）处理SH－SY5Y细胞18d，发现它不仅对细胞活性影响不大，对线粒体膜电位的影响也不明显。虽然Sherer等用可接触剂量处理了足够长的时间，但并未发现对细胞凋亡造成明显的影响，显然通过延长处理时间来达到实验目的在操作上有一定难度。为寻找合适的药物浓度和作用时间，本实验选取不同浓度鱼藤酮培养了24h和48h，分别观察细胞形态变化和细胞活性改变。结果显示，鱼藤酮作用细胞后细胞突起减少皱缩、细胞肿胀、圆缩，部分细胞死亡，这种改变48h组比24h组更明显；MTT结果显示鱼藤酮诱导后细胞活性下降，其中1.0 μmol／L及以上浓度鱼藤酮培养24h和0.5μmol／L及以上浓度鱼藤酮培养48h较空白对照组差异有统计学意义。选取不同浓度鱼藤酮作用于SHSY5Y细胞24h，Western blot法检测α－synuclein表达变化，结果显示1.0μmol／L鱼藤酮培养24h可引起细胞内α－synuclein表达水平上调。既往研究结果也显示，PD细胞和动物模型中均观察到αsynuclein水平上调［9－11］，本研究结果与之相符。为实现模型的高效性及有效性，且更好地模拟疾病的自然过程，需选择相对低浓度及适当的时间建立模型。结合MTT和Western blot结果，低浓度（1.0 μmol／L）鱼藤酮诱导SH－SY5Y细胞24h建立模型可能更好地模拟PD病理过程。

为进一步探讨1.0μmol／L鱼藤酮浓度处理SH－SY5Y细胞24h的细胞模型能否很好地模拟PD的病理改变，本研究通过HE染色、免疫荧光染色进一步观察鱼藤酮诱导后细胞改变。PD重要病理特征是残存多巴胺能神经元出现路易小体和路易轴突，其主要成分是α－synuclein［12］。α－synuclein是一种自然伸展，无折叠构象，在脑内广泛表达的小分子蛋白，α－synuclein的聚集是路易小体形成的重要环节［13］。本实验中，1.0μmol／L鱼藤酮培养24h组和0.5μmol／L鱼藤酮培养48h组，HE染色均观察到嗜伊红、边界清楚的类路易小体样包涵体；免疫荧光染色共聚焦显微镜下，1.0 μmol／L鱼藤酮培养24h组中发现细胞内出现αsynuclein和Thioflavin S共染色阳性颗粒状聚集物。且蛋白电泳也显示了该浓度鱼藤酮可引起αsynuclein表达升高。这些病理改变与Lee等［14］的研究结果一致。1.0μmol／L 鱼藤酮诱导 SHSY5Y细胞24h的模型中出现路易小体形成和αsynuclein的过表达、聚集，均提示该模型可以很好地模拟PD的病理改变。同时，HE染色也显示鱼藤酮诱导后细胞发生核固缩，表明细胞以凋亡为主。以往研究也显示，抑制线粒体复合物Ⅰ活性可引起多种凋亡相关蛋白活化，如caspase－3、Bax、p53等表达上调，提示细胞凋亡在PD多巴胺能神经元死亡中的重要作用，是PD发病过程中多巴胺能神经细胞变性的基本步骤［15－18］。本课题前期结果也显示线粒体复合物Ⅰ抑制剂鱼藤酮诱导后细胞发生早期凋亡［19］，上述结果说明鱼藤酮诱导SH－SY5Y细胞后细胞活性下降并出现细胞凋亡，能够建立多巴胺能神经元凋亡模型，亦符合PD的病理生理过程。

综上，本实验中使用1.0μmol／L鱼藤酮诱导人神经母细胞瘤细胞SH－SY5Y细胞24h，细胞活力明显降低，α－synuclein水平上调，细胞出现凋亡、嗜酸性包涵体形成及α－synuclein染色阳性聚集体形成，提示选用鱼藤酮处理SH－SY5Y细胞能够成功建立神经元早期凋亡模型，符合PD病理改变，成功建立了PD细胞模型，为PD的神经毒性和神经保护作用等实验研究奠定基础，可作为探讨PD发病机制的可靠模型。

［1］Betarbet R，Sherer TB，MacKenzie G，et al.Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson’s disease［J］.Nat Neurosci，2000，3（12）：1301－1306.

［2］东惟玲，方琪，单立冬.新型PD模型研究进展［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2014，（3）：211－214.

［3］Xiong N，Huang J，Zhang Z，et al.Stereotaxical infusion of rotenone：a reliable rodent model for Parkinson’s disease［J］.PLoS One，2009，4（11）：e7878.

［4］张昭文，熊念，张振涛，等.丁苯酞对帕金森病大鼠模型的疗效研究［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2010，17（1）：38－41.

［5］Dawson TM，Dawson VL.Molecular pathways of neurodegeneration in Parkinson’s disease［J］.Science，2003，302（5646）：819－822.

［6］Stephans SE，Miller GW，Levey AI，et al.Acute mitochondrial and chronic toxicological effects of 1－methyl－4－phenylpy ridinium in human neuroblastoma cells［J］.Neurotoxicology，2002，23（4－5）：569－580.

［7］Sherer TB，Betarbet R，Testa CM，et al.Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson’s disease［J］.J Neurosci，2003，23（34）：10756－10764.

［8］Sherer TB，Trimmer PA，Borland K，et al.Chronic reduction in complex Ⅰ function alters calcium signaling in SH－SY5Y neuroblastoma cells［J］.Brain Res，2001，891（1－2）：94－105.

［9］Kalivendi SV，Cunningham S，Kotamraju S，et al.Alpha－synuclein up－regulation and aggregation during MPP＋－induced apoptosis in neuroblastoma cells：intermediacy of transferrin receptor iron and hydrogen peroxide［J］.J Biol Chem，2004，279（15）：15240－15247.

［10］Vila M，Vukosavic S，Jackson－Lewis V，et al.Alpha－synuclein up－regulation in substantia nigra dopaminergic neurons following administration of the parkinsonian toxin MPTP［J］.J Neurochem，2000，74（2）：721－729.

［11］Manning－Bog AB，McCormack AL，Li J，et al.The herbicide paraquat causes up－regulation and aggregation of alpha－synuclein in mice：paraquat and alpha－synuclein［J］.J Biol Chem，2002，277（3）：1641－1644.

［12］Spillantini MG，Crowther RA，Jakes R，et al.Alpha－synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson’s disease and dementia with lewy bodies［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95（11）：6469－6473.

［13］Beyer K，Ariza A.Protein aggregation mechanisms in synucleinopathies：commonalities and differences［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2007，66（11）：965－974.

［14］Lee HJ，Shin SY，Choi C，et al.Formation and removal of alpha－synuclein aggregates in cells exposed to mitochondrial inhibitors［J］.J Biol Chem，2002，277（7）：5411－5417.

［15］Hartmann A，Hunot S，Michel PP，et al.Caspase－3：A vulnerability factor and final effector in apoptotic death of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97（6）：2875－2880.

［16］Eberhardt O，Schulz JB.Apoptotic mechanisms and antiapoptotic therapy in the MPTP model of Parkinson’s disease［J］.Toxicol Lett，2003，139（2－3）：135－151.

［17］Liang Q，Liou AK，Ding Y，et al.6－Hydroxydopamine induces dopaminergic cell degeneration via a caspase－9－mediated apoptotic pathway that is attenuated by caspase－9dn expression［J］.J Neurosci Res，2004，77（5）：747－761.

［18］Swarnkar S，Goswami P，Kamat PK，et al.Rotenoneinduced neurotoxicity in rat brain areas：a study on neuronal and neuronal supportive cells［J］.Neuroscience，2013，230：172－183.

［19］黄杰，张振涛，陈春暖，等.CDK5在鱼藤酮诱导的多巴胺能神经元凋亡中的作用［J］.卒中与神经疾病，2012，19（3）：134－137.