正常与早熟雄性中华绒螯蟹透明质酸酶活性比较

刘欢，顾俊兴，冯超，王海玲，穆淑梅，b，康现江，b

（河北大学a.生命科学学院，b.河北省动物系统学与应用重点实验室，河北保定071002）

正常与早熟雄性中华绒螯蟹透明质酸酶活性比较

刘欢a，顾俊兴a，冯超a，王海玲a，穆淑梅a，b，康现江a，b

（河北大学a.生命科学学院，b.河北省动物系统学与应用重点实验室，河北保定071002）

为分析透明质酸酶在正常性成熟和性早熟中华绒螯蟹雄性生殖系统中活性的差异，进而对正常和早熟雄蟹的生殖能力进行评估，采用透明质酸底物转化法，测定正常和早熟中华绒螯蟹精巢以及副性腺中透明质酸酶的活性，同时考察不同孵育温度对酶活性的影响.研究结果显示：正常性成熟个体的精巢和副性腺中的透明质酸酶活性远远高于早熟个体的酶活性，差异具有高度统计学意义（p＜0.01）；孵育温度对透明质酸酶活性基本上没有影响；正常性成熟个体副性腺中透明质酸酶活性高于精巢酶活性，性早熟个体副性腺中的透明质酸酶活性极低，甚至无法检出.

中华绒螯蟹；透明质酸酶；酶活性；性早熟

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）俗称河蟹（以下简称河蟹）、大闸蟹，隶属节肢动物门（Arthropod）甲壳纲（Crustacca）十足目（Decapoda）方蟹科（Grapsidae）绒螯蟹属（Eriocheir），是我国重要的经济水产养殖蟹类.性早熟蟹是指幼蟹培育过程中性腺当年发育成熟，比正常的性成熟年龄提早1 a.早熟雄性河蟹虽性腺发育速度较快，但从其精子密度及成活率、顶体酶活力和抗氧化能力等各方面来看，均远远劣于正常河蟹[1].河蟹性早熟问题是制约河蟹养殖业发展的一个重要因素，也是经济甲壳动物发育调控的重要问题[2].

透明质酸酶（hyaluronidase，HAase）广泛存在于动物组织中，可以特异性地水解细胞外基质成分透明质酸，从而影响细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动和胚胎发育等多种生命活动[3].根据来源和作用机理的不同，透明质酸酶被分为3类：睾丸型透明质酸酶、透明质酸内切-β-葡萄糖醛酸苷酶和细菌透明质酸酶，又称透明质酸裂解酶[4].测定透明质酸酶活性的方法中，最常用的是透明质酸底物转化法和DMAB法[5-6].

在人类和哺乳类动物体中，睾丸透明质酸酶作为一种对生精及睾丸功能敏感的生化指标常被用于雄性个体的生殖能力分析.本文借鉴此类研究，采用透明质酸酶底物转化法测定正常和早熟雄性河蟹的精巢、副性腺在不同温度下透明质酸酶的活性，对正常和早熟雄性河蟹的生殖能力进行评估，以期为河蟹等经济水产动物的健康养殖和种质保护提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用正常成熟及性早熟河蟹购于河北省唐山市.正常性成熟河蟹质量为（79.2±3.7）g，早熟河蟹质量为（20.1±2.0）g.暂养于实验室水族箱中，备用.

1.2 仪器与试剂

仪器：微型电动组织匀浆机，美国KONTES公司；5430R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；酶标仪，美国Molecular Devices公司.

试剂：透明质酸钠，北京Biotopped公司；N-乙酰氨基葡萄糖、对甲基氨基苯甲醛（DMAB）和透明质酸酶，美国Sigma公司.所有试剂均为分析纯.

1.3 方法

1.3.1 蛋白样品制备

解剖正常性成熟和性早熟雄性河蟹，取精巢0.1 g和副性腺0.3 g置于冰上.分别按照质量体积比1∶3和1∶2加入磷酸缓冲液（pH7.4）.利用微型电动组织匀浆机冰浴匀浆2min，在4℃、12 000 r/min下离心30min，上清液即为蛋白粗提液，记录粗提液体积V样品.

1.3.2 透明质酸酶活性检测

取上述蛋白样品各100μL，分别加入质量浓度为1.5mg/mL的透明质酸钠200μL，37℃/20℃分别孵育60min.加入90℃预热的硼酸钠150μL，煮沸3min.冷却后加入DMAB显色液1.8mL，37℃孵育20min，测定吸光值.以磷酸缓冲液代替样品为阴性对照[7]；以透明质酸酶代替样品为阳性对照.以N-乙酰氨基葡萄糖作为标准品制作标准曲线.

透明质酸酶活性测定：透明质酸酶以透明质酸钠为底物，根据水解产生的N-乙酰氨基葡萄糖的量测定其活力.透明质酸酶活力单位（U）定义：以37℃/20℃孵育条件下，每分钟催化1μmol透明质酸钠水解所需的酶量定义为1U，即一个酶活力单位[8-9].

透明质酸酶活力计算公式[9]：

式中：2.25表示测定酶活力时的加样总体积；V样品表示提取的蛋白粗提液的总体积；MN-乙酰氨基葡萄糖表示N-乙酰氨基葡萄糖的相对分子质量；0.1表示酶促反应体系中加入的蛋白粗提液的用量；60表示反应时间为60min；m样品表示称取组织样品的质量.

1.3.3 数据处理

数据以平均数±标准差表示（M±SD）.使用SPSS19.0统计分析软件进行单因素方差分析.各组数据进行方差同质性检验，差异没有统计学意义（p>0.05）时选择LSD分析，差异具有统计学意义（p＜0.05）时选择Tamhane’s T2（M）分析.

2 结果与讨论

2.1 透明质酸酶活性测定结果

以N-乙酰氨基葡萄糖作为标准品制作标准曲线，方程为y=0.472x+0.046，R2=0.997.

根据实验中所测得的各样品吸光值以及N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线方程，计算出各样品中产生的N-乙酰氨基葡萄糖的量.根据酶活力公式，计算不同孵育温度（37℃、20℃）下正常成熟和早熟雄性河蟹不同组织中透明质酸酶的活性.性早熟河蟹中，3/4个体的副性腺样品，由于其吸光值小于N-乙酰氨基葡萄糖浓度计算公式“y=0.472x+0.046”中的0.046，故由此计算得到的N-乙酰氨基葡萄糖的产生量为负值，说明样品中透明质酸酶活性极低，无法检出.

2.2 正常与早熟雄性河蟹中透明质酸酶活性比较

正常性成熟与性早熟河蟹精巢、副性腺中透明质酸酶活性如表1所示，方差分析结果如表2所示.

表1 正常与早熟河蟹不同组织中透明质酸酶的活性Tab.1 Activity ofhyaluronidase in different tissuesofnormal and precociousmale of E.sinensis U

表2 透明质酸酶活性的方差分析Tab.2 Variance analysison activity of hyaluronidase

由表1和表2可知，早熟河蟹精巢中透明质酸酶的活性显著低于正常成熟河蟹精巢中透明质酸酶的活性，差异具有高度统计学意义（p＜0.01）.正常成熟河蟹副性腺中透明质酸酶的活性较高，而早熟河蟹副性腺中透明质酸酶活性极低，多数个体无法检出，二者差异也具有高度统计学意义（p＜0.01）.

本研究中，正常成熟河蟹精巢和副性腺中蛋白质的质量浓度分别为（14.650±4.452）mg/mL和（15.915± 3.385）mg/mL；早熟河蟹中蛋白质的质量浓度分别为（13.875±4.024）mg/mL和（13.550±1.876）mg/mL.二者组织间的蛋白质浓度差异均无统计学意义（p＞0.05）.而透明质酸酶活性比较结果显示，正常成熟河蟹的精巢、副性腺中透明质酸酶活性明显高于其在早熟河蟹相同2种组织中的活性，说明性腺的过早发育可以影响雄性生殖系统透明质酸酶的活性.精子在精巢中形成，精巢中透明质酸酶活性可能最终影响精子中透明质酸酶的活性，从而影响精子质量.刘强等[1]研究发现，早熟河蟹的精子顶体酶活性显著低于正常成熟精子中的顶体酶活性，而且早熟河蟹精巢组织学和各级精细胞大小与正常蟹相比均趋于小型化，因此，该研究认为早熟河蟹精子顶体酶活性低与其性腺组织结构和性细胞小型化的发育有关.本实验中早熟河蟹精巢的透明质酸酶活性低也可能与其性腺组织结构和性细胞小型化的发育有关.副性腺能使包裹精子的精荚在经过时精荚壁结构松散，从而有利于精子在雌蟹排卵时的释放[10-11].本研究检测早熟河蟹副性腺的透明质酸酶活性时，3/4的个体未检测出有效数值，说明性早熟会导致副性腺中透明质酸酶活性被抑制，其原因有待进一步研究.以往研究[10-11]发现，副性腺蛋白可以破碎精荚壁释放精子；此前作者在提取河蟹精子的实验操作中，亦发现早熟河蟹中副性腺蛋白破碎精荚的效率显著下降.由此推测，早熟河蟹的副性腺中透明质酸酶的活性受到抑制可能是其副性腺蛋白破碎精荚的效率显著下降的原因之一，此推测有待进一步研究证实.总之，早熟河蟹副性腺透明质酸酶的活性较低，可能会导致精子从精荚中游离困难，不利于雌、雄交配后的精卵结合.

2.3 孵育温度对透明质酸酶活性的影响

通常酶的活性与其反应体系的温度有关.正常情况下，哺乳动物体内透明质酸酶的最适温度为37℃；而河蟹是变温动物，其生存最适温度一般为19～25℃.因此，本实验设置了37℃和20℃2个孵育温度，观察孵育温度对透明质酸酶活性的影响，结果如表3所示.由表3中的p值可以看出，不同孵育温度下的透明质酸酶活性差异没有统计学意义（p＞0.05），说明河蟹体内的酶活性可能不会随外界环境温度的变化而发生大幅度改变.

表3 不同孵育温度下透明质酸酶活性的比较Tab.3 Comparison ofhyaluronidaseactivity under different incubation temperatures

2.4 不同组织中透明质酸酶活性的比较

同种类河蟹，相同孵育温度下，检测精巢和副性腺中透明质酸酶活性.表4中的方差分析结果显示，不论是早熟还是正常河蟹中，相同孵育温度下精巢与副性腺中透明质酸酶活性之间的差异都具有统计学意义（p＜0.05）.已有研究[12-14]发现，不同来源的透明质酸酶具有不同的功能，因此活性可能存在差异.

表4 同类河蟹不同组织透明质酸酶活性的比较Tab.4 Com parison ofhyaluronidase activities in different tissuesof same crab

3 结论

本实验采用透明质酸底物转化法，分析不同孵育温度（37℃和20℃）下正常与早熟雄性河蟹不同组织（精巢、副性腺）透明质酸酶的活性差异.研究发现：2个孵育温度对河蟹透明质酸酶活性无影响；正常性成熟河蟹精巢和副性腺中的透明质酸酶活性均显著高于性早熟河蟹相同组织中的透明质酸酶活性.正常河蟹中，副性腺中透明质酸酶的活性显著高于精巢中的酶活性；早熟河蟹中，副性腺中的透明质酸酶活性非常低，2个孵育温度下均检测不到.由此认为，早熟将影响雄性河蟹的生殖能力.

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（责任编校 纪翠荣）

Com parison on the activity of hyaluronidase between normaland precociousmale of Eriocheir sinensis

LIUHuana，GU Junxinga，FENGChaoa，WANGHailinga，MU Shumeia，b，KANGXianjianga，b
（a. College of Life Sciences，b. The Key Laboratory of Zoological Systematics and Application，Hebei University，Baoding 071002，Hebei Province，China）

In order to evaluate the reproductive capacity in normaland precociousmale crabs（Eriocheir sinensis），the differenceofhyaluronidase（HAase）activities in reproductive system between normaland precociousmale crabswasdetermined. The HAase activities in the testis and accessory sex gland were calculated by the method of substrate conversion.The influence of different incubation temperatures on the HAase activitieswas investigated aswell.The results showed that the activities of HAase in the testis and accessory sex gland of normalmale crabs were significantly higher than that in the precocious ones（p＜0.01）.Incubation temperature had imperceptible effect on the activity of HAase.In normal sexual maturationmale crabs，the HAase activities in the accessory sex gland were higher than that in the testis.In the precocious male crabs，the HAase activities in the accessory sex gland were extremely low,which even could notbe detected.

Eriocheir sinensis；hyaluronidase；enzymatic activity；sexual precocity

Q955

A

2015-03-13

国家自然科学基金资助项目（31202000，31272309）；河北省自然科学基金资助项目（C2011201028）；河北大学博士基金资助项目（2012-239）；河北省重点实验室运行补助费资助项目（14967611D）.

刘欢（1989—），女，硕士研究生.

康现江（1964—），男，教授，主要从事细胞发育分化及其调控方面的研究.

1671-1114（2015）03-0102-03