DNA条形码技术在双翅目昆虫中的应用

闫娇，姜丽，郭琴，王新华，闫春财

（1.天津师范大学a.生命科学学院，b.天津市动植物抗性重点实验室，天津300387；2.南开大学生命科学学院，天津300071）

DNA条形码技术在双翅目昆虫中的应用

闫娇1，姜丽1，郭琴1，王新华2，闫春财1

（1.天津师范大学a.生命科学学院，b.天津市动植物抗性重点实验室，天津300387；2.南开大学生命科学学院，天津300071）

双翅目昆虫为完全变态发育，多个物种幼虫和蛹形态相似、同一物种不同发育阶段数据缺乏等问题都为双翅目昆虫的物种鉴定带来困扰.DNA条形码技术的有效性已被证实，广泛应用于分类学等多个领域.本文概述了DNA条形码技术在双翅目昆虫中的应用以及对该技术和方法提出的改进.

DNA条形码；线粒体COI基因；双翅目

双翅目是昆虫纲中仅次于鞘翅目、鳞翅目、膜翅目的第4大目，包括蝇、蚋、蚊、蠓等，物种丰富，分布广泛.双翅目昆虫会引发或传播人类某些重大疾病，如驯鹿皮蝇（Hypoderma tarandi）可造成眼内蝇蛆病[1]；蚊子吸人畜血液，是虫媒病传播过程中重要的媒介生物[2].双翅目昆虫对农林畜牧业也有重要影响，如南美斑潜蝇（Liriomyza huidobrensis）是对蔬菜和园艺作物造成重大损失的害虫[3]；蕈蚊科昆虫能为植物完成授粉作用[4]；Lixadmontia franki Wood&Cave幼虫（寄蝇科）寄生在象鼻虫（Metamasius callizona）体内，是噬咬凤梨科植物的入侵象鼻虫害虫的重要天敌，可作为害虫生物控制的调节者[5].有些双翅目昆虫可以作为水体污染的指示生物，如摇蚊科幼虫的生态需求和生活习性因种属的不同而存在差异，对环境因子敏感性也不同，是水环境监测的优良指示生物[6].可见，双翅目昆虫与人类生活息息相关，具有重要的研究价值.

DNA条形码技术自2003年提出以来发展迅速，被广泛应用于动植物的分类鉴定[7-14].同传统的形态学分类鉴定相比，DNA条形码技术的优势在于其不受实验对象的雌雄和发育阶段的限制，不受表型可塑性和遗传可变性的影响，对鉴定者本身也没有严格的专业背景要求[15].在动物分类学研究方面选用的基因序列，首选线粒体基因（COI、COⅡ），其次是核糖体内转录间隔区基因（ITS-1，ITS-2）、5.8S rDNA、EF-1α基因、白眼基因（White gene）和CAD基因等.在双翅目昆虫的研究中，DNA条形码技术主要应用于物种鉴定和系统发育分析，本文从以下5方面对其进行综述.

1 DNA条形码技术在物种鉴定中的应用

传统分类学方法的局限主要有3方面：①表型可塑性和遗传多样性会导致物种的错误鉴定；②对于变态发育的双翅目昆虫来说，形态学鉴定的特征大多只针对雄成虫，而雌成虫和幼虫等发育阶段因形态相似难以鉴定到种；③分类学专业术语以及特征的判断需要专业的知识背景.而以DNA序列为基础的分子分类可以为分类学带来进一步的发展，如鉴定物种、发现新种和隐存种等.目前，DNA条形码技术在蠓科、蚋科、实蝇科、摇蚊科、蚊科等多个双翅目类群中的鉴定均有报道[16-29].

Meeyen等[16]利用COI基因对辣椒实蝇（Bactrocera latifrons，实蝇科）进行了分子分类鉴定，鉴定成功率为100%，证实了COI基因作为DNA条形码技术分子标记的有效性.朱振华等[17]选用mtDNA CytB基因，以果实蝇属的桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）、瓜实蝇（B. cucurbitae）、南瓜实蝇（B.tau）、番石榴实蝇（B. correcta）、具条实蝇（B.scutellata）、黑漆实蝇（B. scutellaris）等6种实蝇为实验对象，经分析得出，mt DNA CytB基因片段有30个位点稳定性较高，种内遗传距离为0～0.019，种间遗传距离为0.059 24～0.191 33，种间差异大于种内差异，因此mtDNA CytB基因可作为这6种实蝇分子鉴别的依据.Gao等[18]利用条形码技术，选用COI基因，鉴定出云南地区果蝇科Luzonimyia属和Pararhinoleucophenga属各2个果蝇新种，An等[19]也鉴定出云南地区果蝇科Phortica属Ashima亚属的3个新种.台湾地区冠果蝇属（Stegana Meigen）的种类在形态分类中数据欠缺，Zhang等[20]利用COI基因（568～708 bp），结合形态观察，将其鉴定至种，为今后冠果蝇属的物种鉴定提供了分子依据和形态学依据.Guo等[21]同时采用COI基因（700 bp）和period基因（678 bp）鉴定麻蝇科（Sarcophagidae）物种，结果表明，同时选用线粒体COI基因和核基因period基因时，物种鉴定会更准确.

Nielsen等[22]利用COI基因片段和形态学鉴定相结合，发现了蠓科（Ceratopogonidae）库蠓亚属（subgenus Culicoides）的3个新种.Stur等[23]将条形码技术和形态学方法相结合，选用COI序列对挪威芬马克地区的蠓科9属54种223个样本进行研究的结果表明，除3个形态种含有多个条形码索引号（Barcode Index Numbers，BINs），可能存在隐存种之外，其他物种的DNA条形码数据与形态学鉴定结果一致，表明COI基因在蠓科物种鉴定中的有效性.Nielsen等[24]用ITS-1序列对蠓科（Ceratopogonidae）库蠓属（Culicoides）进行物种鉴定，表明ITS-1基因在蠓科物种鉴定中的有效性.Renaud等[25]选用蝇科（Muscidae）25属160种1 114个样本，扩增COI序列，构建数据库，为今后鉴定蝇科物种提供依据.以往根据形态学特征很难将黑蝇的幼虫鉴定到种，Pramual等[26]将泰国地区黑蝇未知幼虫与已知成虫COI基因序列进行比对，结果显示未知幼虫为Simulium chaliowae和S.bullatum，这表明条形码技术能将黑蝇幼虫与成虫阶段相匹配，从而为幼虫的物种鉴定提供依据.赫坎按蚊种团（Hyrcanusgroup）中物种关系密切且广泛分布于东洋区和古北区，Ma等[27]利用ITS-2序列对其进行物种鉴定，实验扩增ITS-2片段长度为436～469 bp，种内差异0～0.4%，远小于种间差异，因此ITS-2可作为赫坎按蚊种团物种鉴定的分子标记.

Carew等[28]选用COI和CytB基因片段对摇蚊科昆虫进行物种鉴定，结果显示COI基因（395 bp）平均种内核酸差异为0～4.2%，平均种间差异为8.7%～34.1%；CytB基因（343bp）平均种内核酸差异为0～4.4%，平均种间差异为7.0%～34.1%，种间差异远高于种内差异.COI和CytB基因片段均可有效鉴定摇蚊科物种，但COI基因鉴定成功率（96%）高于CytB基因鉴定成功率（83%），而同时选用COI和CytB基因时，鉴定成功率高达99%.摇蚊科物种丰富，但在评估物种丰富度时，由于雌虫在形态上不易鉴定，研究的主体往往只是雄虫.鉴于一些摇蚊物种是孤雌生殖，忽略雌虫就可能造成评估不准确，Ekrem等[29]利用DNA条形码技术对采自挪威中部保护区的摇蚊雌雄成虫进行物种鉴定，并将同一物种的雌雄成虫进行匹配，77.6%的雌虫可鉴定到种，其余雌虫仅能鉴定到属.结果表明，当把雌虫考虑在内时，记录种的数量增加了27%，使评估得到的物种丰富度数据更加真实.

2 DNA条形码技术在系统发育分析中的应用

DNA条形码本身不能用于系统发育分析，但由于DNA条形码获得的基因序列具有物种差异性，因此可用来构建系统发育树，进行系统发育分析.Sari等[30]用COI基因（653 bp）对摇蚊科各亚科（26属70种）进行了系统发育分析，最大似然法（ML）分析显示，除长足摇蚊亚科（Tanypodinae）以外，其他亚科均为单系；摇蚊亚科（Chironominae）与直突摇蚊亚科（Orthocladiinae）为姐妹群.在摇蚊族（Chironomini）中，除多足摇蚊属（Polypedilum）外，摇蚊属（Chironomus）、隐摇蚊属（Cryptochironomus）、内摇蚊属（Endochironomus）和间摇蚊属（Paratendipes）均为单系.在长跗摇蚊族（Tanytarsini）中，拟长跗摇蚊属（Paratanytarsus）和枝长跗摇蚊属（Cladotanytarsus）为单系，长跗摇蚊属（Tanytarsus）和小突摇蚊属（Micropsectra）非单系.而无突摇蚊属（Ablabesmyia Pentaneurini）在邻接法（NJ）分析中为单系，在ML分析中为非单系.Wang等[31]选用28S rDNA序列中高变区D1序列（28S rDNA D1），以长足摇蚊亚科中（Tanypus punctipennis）和（Procladius choreus）为外群，用邻接法和最大简约法（MP）构建系统发育树，对直突摇蚊亚科中12个代表性属级阶元进行分子系统学研究.结果表明，心突摇蚊属（Cardiocladius）和真开氏摇蚊属（Eukiefferiella）聚为一支，流环足摇蚊属（Rheocricotopus）和刀突摇蚊属（Psectrocladius）聚为一支.结果与基于形态学的系统发育分析一致.

Jiang等[32]选取73个果蝇种的1 426个个体，利用NJ法、BM法、BCM法和MD法对条形码数据进行分析，结果显示种间平均距离为14.04%，种内平均距离为0.81%.另外，果蝇复合体存在时，条形码鉴定成功率下降，其中BM法和BCM法成功率为74.4%，MD法为84.8%.若将复合体作为单一类群可获得较高成功率（BM 98.9%，BCM 98.5%，MD 97.5%）.从系统树可看出，Bactrocera dorsalis复合体、B.tryoni复合体、B. mesomelas（Bezzi）、B.calumniata（Hardy）、B.cucurbitae和B.tau（Walker）中的大多数物种为并系，B.dorsalis复合体中的B.cognata（Hardy&Adachi）和B.trivialis（Drew）为多系类群，B.zonata复合体中的B.correcta（Bezzi）、B.tuberculata（Bezzi）、B.zonata（Saunders）和B. tau复合体中的B.bezziana（Hering）、B.tau互为单系类群.

Jamnongluk等[33]用COI序列探讨果实蝇属（Bactrocera）中4亚属（Asiadacus、Bactrocera、Hemigymnodacus、Zeugodacus）的分子系统关系.分别用MP法和NJ法（Jukes-Cantor模型）构建系统发育树，所得系统树的拓扑结构非常相似.结果显示所有序列明显分为2支：Asiadacus、Hemigymnodacus和Zeugodacus聚为1支，Bactrocera单独为1支.相比于Bactrocera而言，Asiadacus、Hemigymnodacus和Zeugodacus相互之间关系更密切.分子系统分析结果符合形态分类结果.Bourke等[34]用COI（638 bp）、ITS（432 bp）、白眼基因（716 bp）这3个基因片段，对Anopheles strodei亚群进行鉴定并分析其系统发育关系.分别用贝叶斯法建树，选用COI的53个片段，选用ITS的49个片段，选用白眼基因的57个片段，外群为A.kompi Edwards、A.lutzii Cruz和A.galvaoi Causey.COI基因鉴定成功率为92%，但不能鉴定出A.albertoi和A.strodei；ITS-2鉴定成功率为60%.使用多重位点COI-ITS-2时，鉴定成功率为100%.贝叶斯法分析显示，系统发育树分为7支，与原有研究一致.

3 DNA条形码技术在其他方面的应用

3.1 DNA条形码技术在法医学中的应用

蝇科、丽蝇科、麻蝇科和小家蝇科等均为双翅目嗜尸性昆虫，因此根据其生活特性，可用来推测凶杀案的案发时间与发生时间的间隔（the postmortem interval，PMI），为刑侦学提供线索.在法医学中，测定尸体上不成熟期蝇类的发育龄期是估计PMI的关键. Sonet等[35]认为，以DNA分析为基础，利用COI序列对各个发育阶段的蝇类进行有效物种鉴定是十分必要的.Jordaens等[36]以麻蝇科麻蝇属56种126个样本为实验对象，结合GenBank数据，共分析99种270个COI片段，结果表明迷你条形码（127 bp）的成功率较低（80.7%～82.7%），但658 bp的COI序列和COI全长（1 535 bp）在嗜尸性昆虫麻蝇属鉴定中成功率高达98.2%～99.3%.Meiklejohn等[37]分析了澳大利亚麻蝇科16种85个样本，结果显示：种间差异为6.658%～8.983%，种内差异为0～1.499%，条形码间隔（gap）明显，96.5%的标本可成功鉴定到种，COI序列可作为澳大利亚麻蝇科分子鉴定的有效工具.Boehme等[38]用条形码技术鉴定了蚤蝇科6种（Megaselia scalaris、M. giraudii、M.abdita、M.rufipes、Conicera tibialis、Puliciphoraborinquenensis）.对法医学而言，麻蝇物种鉴定可能因不同地区环境及群落结构的差异而导致错误鉴定.Guo等[39]在中国10个省市13个采样位点采集到23个麻蝇样本，采样范围东至山东临沂（35°05′E，118°35′N），西北至新疆乌鲁木齐（43°46′E，87°36′N），南至海南万宁（18°80′E，110°39′N）.实验选用COI基因（278 bp）和16S rDNA（289 bp）这2个基因片段，结果显示所获样本为4个种，分别为Boerttcherisca peregrina、Helicophagellamelanura、Parasarcophaga albiceps和Parasarcophaga dux.系统树中节点支持率高，表明COI和16SrDNA可对麻蝇进行有效物种鉴定.

3.2 DNA条形码技术在环境保护中的应用

Brabrand等[40]为了解黑蝇（Simulium truncatum）在挪威Agardselva河流域每年爆发的原因，利用DNA条形码技术对采样获得的卵和幼虫进行物种鉴定，从而得出S.truncatum产卵和卵孵化的主要区域，同时将此物种卵的主要分布区域与S.venustum类群中其他物种区域相区分.通过对比该区域的环境因素，发现这些区域之间明显沿着一条人工河渠分布，由此解释了S.truncatum的爆发原因，这表明条形码技术对水体环境的变化及监测有重要意义.

生物入侵是环境多样性和生态平衡的重要威胁[41].因此在进出口的检疫工作中，需要将未知物种（包括蛹、幼虫、成虫）迅速并有效鉴定，判断其是否为入侵物种.由于在形态分类学鉴定中，蛹和幼虫鉴别特征不明显，给检疫工作带来困扰，而DNA条形码技术可以解决这些难题.Uechi等[42]发现日本冲绳县（Okinawa Prefecture）的2种植物（Pseuderanthemum laxiflorum、Jasminum sambac）和三重县（Mie Prefecture）的1种植物（Dendrobium spp.）花蕾均被瘿蚊感染，经过形态学鉴定和分子鉴定发现Contariniamaculipennis为日本入侵物种，且在该地区为首次记录.Hu等[43]利用COI基因（782 bp）对中国入侵物种瓜实蝇（Bactrocera cucurbitae Coquillett）进行了分子研究，揭示中国沿岸7个地理种群的基因多样性极低，在取样范围内，发现亚洲东南部的瓜实蝇实为1个世系.实蝇科昆虫中包括一些重要的农业害虫，为给检疫工作提供便利，Li等[44]基于DNA条形码建立了TBIS网站（Tephritid Barcode Identification System），含实蝇科150种400个COI序列，后期将逐渐添加形态学特征描述以及图片介绍、寄主和地理分布等具体内容，以期成为检疫技术的有力工具.综上所述，DNA条形码对物种鉴定的有效性可以为生物入侵的检测与控制提供新的支持.

3.3 DNA条形码技术在医学和畜牧学中的应用

在人畜传染病中，虫媒病较多.双翅目昆虫如蠓、蚋、蚊、虻类等吸食人畜血液，是细菌、病毒等病原生物得以传播和扩散的媒介.蚊子作为媒介引起的登革热早已引起关注，但在巴基斯坦，鲜有人研究蚊类多样性.由于种间形态差异较小，很难评估该地区的蚊类多样性和分布.直到2014年，Ashfaq等[45]选用COI序列，在该地区成功分析1 684个样本（成功率87%），其中致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）占61%，伊蚊属（Aedes）种类占15%（A.albopictus和A.aegypti为优势种），疟蚊属（Anopheles）占6%.根据形态学特征可鉴定出21种，如将所得基因序列与生命条形码数据系统（Barcode of Life Data Systems，BOLD）及GenBank数据对比，可增加记录11种，其种内差异为0～2.4%，种间差异为2.3%～17.8%.

蠓科库蠓属（Culicoides）的一些种类是蓝舌病病毒的中间媒介，在北欧地区曾引发大规模蓝舌病.Lassen等[46]用COI序列对Culicoides的种类进行分析，表明其种内差异＜1%，COI序列可成为库蠓属的分子标记. Lassen等[47]对库蠓属昆虫的吸食血液进行分子鉴定，表明库蠓属常见寄主为牛、狍、马、野鸭及斑鸠等，其中牛占73.9%，斑鸠占18.3%，表明其在选择寄主时具有偏向性.

4 DNA条形码技术的改进

获取DNA条形码数据的主要步骤为：提取总DNA；PCR扩增目标片段，琼脂糖凝胶电泳检测，微量蛋白核酸仪检测目标片段的纯度；将电泳所得片段进行割胶回收纯化，测序；最后将测序序列进行数据分析和处理，包括登录NCBI网站进行BLAST比对，分析序列的碱基组成并计算简约信息位点、保守位点、变异位点的个数以及替代颠换饱和度分析，可构建系统发育树.提取总DNA时可采用传统方法（如CTAB、NaCl、SDS法）和试剂盒法.

从标本到DNA条形码分子标记的获得耗时费力，Wong等[48]以摇蚊为实验材料，省去DNA提取相关步骤，做直接PCR（directPCR），证明优化后的成功率高达90%.实验高成功率的关键在于选取组织的质量、身体部位、所用引物和Taq酶类型等方面.特别指出取材对直接PCR的成功率有直接影响：取成虫足进行直接PCR的成功率（100%）要远高于整只取材（成虫体长＞2.5mm时，成功率为0）.对其他无脊椎动物类群的研究中发现直接PCR技术并不适用于外骨骼加厚及外分泌腺过多的昆虫.

实验材料放置时间过久容易造成DNA降解，导致基因提取和PCR成功率下降，无法获得目标片段.因此对于保存已久的样本，DNA条形码技术无法体现其优势.Hernandez-Triana等[49]研究博物馆内保存已久（保存时间大于10 a）的蚋科样本（2属36种271个样本）时，选用6个不同的引物对进行扩增，结果从215个样本中获得了有效序列，如表1所示.该研究强调了当实验材料保存过久时必须选用合适的引物对组合才能得到目的片段.

表1 引物对的选用及成功率Tab.1 Primer pairsadopted to obtain shortbarcode sequencesand success rates

Kim等[50]认为种间和种内样品量的不足以及类群间的突变可能会影响DNA条形码间隙的解释和分析，使用新的指标则能够迅速和准确地评估DNA条形码间隙.使用新指标界定条形码间隙时，能够鉴定出隐存种.在韩国摇蚊数据库里，Dicrotendipes pelochloris种间差距明显（种间距离0.138，种内距离0.050，条形码间隙IndexBarcodeGap0.341），但Cricotopus tricinctus差异不明显（种间距离0.010，种内距离0.004，IndexBarcodeGap0.967），因此Kim等定义了DM值，该DM值为平均种间遗传距离，依赖于目标物种的遗传变异和数据库.DM-最小种间遗传距离（DminInter）和DM-最大种内遗传距离（DmaxIntra）可以避免当种内变异为0时，DNA条形码间隙被错误解释.运用此概念，计算出IndexBarcodeGap和最佳临界值IndexCutoff，检测了7个昆虫条形码数据库Profile 100 Insect Families、Ephe-meroptera of North America（EPCHU）、Trichoptera of Churchill 2002-2007、Chilean Smicridea、Caddisflies of New Zealand、Moths of Ontario和BOLD Chironomids的有效性，进而鉴定出14个隐存种，结果如表2所示.

表2 利用新指标鉴定出的隐存种Tab.2 Summary of COI genetic divergence to predict cryptic species in insect datasets

5 结语

DNA条形码技术是一种能够对物种进行快速、有效鉴定的工具，在动植物分类鉴定中具有重要作用，为分类学研究开辟了新途径.DNA条形码自提出以来备受关注，得到多个领域学者的支持.在昆虫分类学研究中，DNA条形码不受虫态限制，对实验对象形态完整性没有要求（部分组织器官、血液等均可）；它操作简便，可大批量同时进行，大大简化了繁重的物种鉴定工作.常用的分子标记基因COI、COⅡ和ITS片段等可直接采用其通用引物进行扩增，物种不同不需重新设计引物.随着DNA条形码技术的发展，迷你条形码、直接PCR、下一代测序技术等的提出与应用均为这项技术添加了新的活力.DNA条形码不仅能进行物种鉴定，还能进行系统发育分析.在双翅目昆虫的应用中，为进化生物学、医学、畜牧学、法医学、生态学、进出口检疫等的研究和应用奠定了基础.

然而在其广泛应用中，不足之处也逐渐显现：①核基因组中线粒体假基因（NUMTs）的干扰，会导致实验结果出现假阳性，可能对物种鉴定和系统发育分析造成错误解释；②目前DNA条形码对物种界定并没有统一的标准，普遍认为种间差异大于2%或种间差异大于种内差异10倍时即为不同种，但当种间差异和种内差异不明显并出现重叠时，DNA条形码便不能进行有效鉴定；③采用不同基因作为分子标记会影响物种鉴定的有效性以及系统发育树的构建；④COI基因在鉴定动物物种时成果显著，但其在植物中进化速率较慢、变异少，因此COI基因不适用于植物的物种鉴定；⑤构建系统树采用的建树方法不同时，可能反映的种间、属间情况不一致[31]；⑥DNA条形码不能有效鉴定一些较小类群[51]，不能客观解释一些类群的系统发育关系[52]；⑦采用不同引物对获得目标片段的成功率可能有影响，采样量大小也可能对结果有影响.

尽管DNA条形码技术有不足之处，但不可否认的是它在多个类群中均具有效性.DNA条形码技术不可能完全取代形态学分类方法，它可以作为形态学鉴定的辅助工具，为传统的物种鉴定提供分子依据.也就是说，将形态学分类与分子分类相结合，会使物种鉴定结果更科学更准确，这是分类学发展的方向.目前交叉学科的兴起和发展为众多领域带来生机，DNA条形码技术可结合生态学、系统学、法医学、动物行为学、进化生物学、生物地理学等学科，利用学科互补开拓新的研究领域.

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（责任编校 纪翠荣）

Application of DNA barcoding in Dipteran insects

YAN Jiao1，JIANG Li1，GUOQin1，WANGXinhua2，YANChuncai1
（1a. College of Life Sciences，1b. Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；2. College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin 300071，China）

Dipteran insects have completemetamorphosis development.It′s hard to diagnose the sibling species due to the similarities in externalmorphology of larva and pupa among differentspeciesand the lack ofdata ofeach developmental stage for the same species.DNA barcoding has been proved to have significant efficiency in species identification in previous studiesand iswidely applied.This paper summarized the applications of DNA barcoding in Dipteran insects.Meanwhile，the improvementsof technology and approacheswere proposed aswell.

DNA barcoding；mitochondrial COI gene；Diptera

Q969

A

2015-02-20

国家自然科学基金资助项目（31101653，31272284）；天津市自然科学基金资助项目（14JCQNJC14600）；天津市高等学校科技发展基金资助项目（20090608）；天津师范大学引进人才基金资助项目（5RL104）；天津市优秀青年教师资助计划（2013）；大学生创新创业训练计划资助项目（2015031，201410065046）.

闫娇（1990—），女，硕士研究生.

闫春财（1979—），男，副教授，主要从事昆虫系统学方面的研究. .

1671-1114（2015）03-0066-07