基于线粒体Cytb基因序列探讨花斑鳅三亚种的分类地位

陈咏霞，梁娜，李秀，潘晓睿，武大勇

（1.河北大学生命科学学院，河北保定071002；2.衡水学院生命科学系，河北衡水053000）

基于线粒体Cytb基因序列探讨花斑鳅三亚种的分类地位

陈咏霞1，梁娜1，李秀1，潘晓睿1，武大勇2

（1.河北大学生命科学学院，河北保定071002；2.衡水学院生命科学系，河北衡水053000）

以线粒体DNA细胞色素b（Cytb）基因的全序列作为遗传标记，探讨花斑鳅3亚种（指名亚种Cobitismelanoleuca melanoleuca、北方鳅亚种C.m.granoei和格氏鳅亚种C.m.gladkovi）的分类地位.基于Kimura双参数法计算河北花斑鳅指名亚种个体间的遗传距离为0.2%～1.1%，俄罗斯花斑鳅指名亚种、北方鳅亚种和格氏鳅亚种之间的平均遗传距离为0.1%～1.5%，而河北花斑鳅指名亚种与俄罗斯花斑鳅3个亚种之间的平均遗传距离为1.7%～2.6%.分子系统树显示，花斑鳅分为两大分支：分支I为河北花斑鳅指名亚种8个单倍型类群，分支Ⅱ含俄罗斯花斑鳅指名亚种、北方鳅亚种和格氏鳅亚种以及辽宁北方鳅亚种.结合已有研究结果得出：花斑鳅指名亚种仅分布于中国，而俄罗斯也仅有北方鳅亚种1个物种，两者的分化时间约为2.50～3.09百万年.

花斑鳅；线粒体细胞色素b基因；遗传标记；遗传距离；分类地位

鳅属（Cobitis）隶属于硬骨纲（Osteichthyes）鲤形目（Cypriniformes）鳅科（Cobitidae），为淡水底层鱼类，喜栖息于砂泥底质的清澈流水环境中，少数栖息于湖泊内，广泛分布于古北区和东洋区[1-2].据统计，世界鳅属鱼类约有84种[3-4]，是鳅科种类最为繁盛和分化最为明显的属之一.

鳅属鱼类因其高度的表型可塑性、两性异型和小生境适应性，给该类群的形态分类与物种鉴定带来很大困难[5-6]，导致其近缘种的分类和命名非常混乱，同物异名现象时有发生[7-8].过去，鳅属的模式种花鳅（C. taenia Linnaeus，1758）被认为是广泛分布的多型种，欧亚大陆的许多鳅鱼被记述为花鳅或其亚种.例如，Nichols[9]描记的新亚种花斑鳅（C.t.melanoleuca Nichols，1925，模式产地：中国山西省清徐县附近的汾河），Rendahl[10]描记的新亚种北方鳅（C.t.granoei Rendahl，1935，模式产地：俄罗斯西伯利亚鄂木斯克附近的额尔齐斯河）以及Gladkov[11]描记的新亚种西伯利亚鳅（C.t. sibirica Gladkov，1935，模式产地：俄罗斯乌拉尔南部Turaoiak湖泊）.

Berg[12]认为北方鳅和西伯利亚鳅为同种，北方鳅是西伯利亚鳅的次定同物异名.Bǎcescu和Maier[13]将西伯利亚鳅提升为种.但是，Nalbant等[14]认为北方鳅是有效种名，并描记了蒙古鳅新亚种（C.granoeiolivai Nalbant，Holcík etPivnicka，1970，模式产地：蒙古后杭爱省色楞格水系鄂尔浑河支流Ogijn湖泊和Narijn河）.Vasil’eva[15]也认为北方鳅是西伯利亚鳅的先定同物异名，但是根据形态特征及核型分析，他否定了蒙古鳅亚种的有效性.Nalbant[5]研究了花斑鳅的模式标本（1920年采自中国山西清徐）和俄罗斯西伯利亚库达河（Kuda）与Ordinskoe湖泊北方鳅标本的形态特征，指出花斑鳅与北方鳅并没有明显差异，并根据命名优先原则，认为花斑鳅是北方鳅的先定同物异名，并认为花斑鳅广泛分布于黄河以北包括韩国、蒙古、俄罗斯和哈萨克斯坦等地区.Kottelat[16]对采自蒙古克鲁伦河（Kherlen）、色楞格河（Selenge）和布尔干河（Bulgan）的鱼类进行体色斑纹研究，也认为蒙古鳅亚种、北方鳅和西伯利亚鳅均为花斑鳅的次定同物异名.之后，Prokofiev[17]检视采自蒙古鄂尔浑河（Orkhon）鳅鱼的体色斑纹，将蒙古鳅亚种（C.granoeiolivai）提升为种.Vasil’ev等[18]依据核型分析，认为蒙古鳅和西伯利亚鳅是北方鳅的次定同物异名，并认为北方鳅是花斑鳅的亚种（C.melanoleuca granoei），同时又描记新亚种格氏花鳅（C.melanoleuca gladkovi Vasil’ev et Vasil’eva，2008，模式产地：俄罗斯Staraya Stanitsa州，Starodubovka村，顿河支流北顿涅茨河）.然而，Perdices等[8]依据Cytb、RAG1、S7和RHO等基因序列对采自俄罗斯的北方鳅亚种（C.m.granoei）、格氏花鳅亚种（C.m.gladkovi）和花斑鳅指名亚种（C.m. melanoleuca）进行研究后认为，北方鳅和格氏花鳅均为花斑鳅的次定同物异名.

虽然对花斑鳅及其亚种的分类地位进行了很多研究报道，但中国的种群数据缺乏，其研究结果仍存在疑问.为了进一步确立花斑鳅及其亚种的分类地位，本文通过分析中国、韩国、俄罗斯等地区花斑鳅及其亚种的线粒体Cytb基因序列在种间、亚种间的变异，以探讨花斑鳅及其亚种的分类地位.

1 材料与方法

1.1 实验材料

采用电网和虾笼捕捞鳅属鱼类.于2013年4—10月份采集于河北省拒马河（易县紫荆关）、洋河（下花园区鸡鸣驿）、汤河（丰宁邓珊子村）、滦河（塞罕坝）和白河（赤城县田乡）.标本浸泡于体积分数95%的乙醇中，-20℃保存备用.标本保存在河北大学博物馆.

1.2 DNA提取、序列扩增及测定

采用上海捷瑞生物有限公司生产的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取纯化花斑鳅基因组DNA.用于扩增线粒体Cytb的引物分别为L14724（5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′）和H15915（5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′）[19].PCR反应体系总体积为50μL，其中：引物浓度1.0μmol/L各2μL，DNA模版4μL，2×Taq MasterMix Loading Dye 25μL，ddH2O 17μL.PCR反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次；72°C延伸10min，4℃终止反应.

PCR产物经质量分数为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测后，用胶回收试剂盒（天根生化科技有限公司）进行PCR产物的回收和纯化.纯化后的PCR产物由北京诺赛基因组研究中心进行双向测通.

1.3 基因序列信息及数据分析

从GenBank下载了花斑鳅指名亚种（C.m. melanoleuca）、格氏花鳅亚种（C.m.gladkovi）、北方鳅亚种（C.m.granoei）、西伯利亚鳅亚种（C.m.sibirica）（=北方鳅亚种）、乔氏鳅（C.choii）、太平鳅（C.pacifica）、四线鳅（C.tetralineata）和韩鳅（C.hankugensis）等鳅属鱼类28个个体的Cytb基因同源序列，与本研究所检测的12个个体（白河（HBBH）2个个体、汤河（HBTH）2个个体、拒马河（HBJMH）3个个体、洋河（HBYH）3个个体和滦河（HBLH）2个个体）的Cytb基因序列，共计40个一并分析.另选取与鳅属亲缘关系较近的萨瓦纳鳅属（Sabanejewia）的南斯拉夫萨瓦纳鳅（Sabanejewia balcanica）作为外群进行系统发育分析，相关信息见表1.

使用BioEdit7.2.5软件进行同源序列拼接、排列及手动矫正.用DnaSP 5.10软件[20]确定所测序列的单倍型.利用MEGA 5.0软件[21]对测定序列和GenBank下载的序列进行比对，排序后去除两端冗余序列，统计序列的平均碱基组成、变异位点、简约信息位点数、转换/颠换比率（Ts/Tv）和遗传距离，其中遗传距离的计算采用Kimura双参数进化模型.

表1 本研究中所分析的鳅属鱼类和来源Tab.1 Speciesand sourcesof Cobitis studied

采用最大似然法（ML）和贝叶斯法（BI）构建分子系统树，并用jModelTest2.1.4软件[22]选择最适合的进化模型.运用MEGA 5.0软件构建ML法的分子系统树，替代模型为GTR，进行1 000次自展分支检验.应用MrBayes 3.0软件[23]构建BI法分子系统树，随机选取起始树，以后验概率（posterior probability，PP）来表示各分支的可信度.替代模型根据hLRTs检验结果设定为“nst=6 rates=gamma”，计算出最适合的替代模型为GTR+G+I.马尔科夫链的蒙特卡洛方法（Markov chain MonteCarlo process）设置为4条链同时运行2×106代，3条热链1条冷链.计算2×106代，每100代对系统树进行抽样，最终得到20 001棵系统发育树，重复一次以保证所获得结果的准确度.将运行过程中所得的对数似然值（Log-likelihood scores）与相应代数进行作图，找到对数似然值达到饱和的位置，饱和前的数据被作为老化样本而舍弃.在舍弃老化样本（burn-in=4 000）后，根据剩余的样本构建一致树（consensus tree）并计算相关参数.

2 结果与分析

2.1 碱基组成及序列变异

所测定的河北省5条河流12个个体的线粒体Cytb基因序列（1 140 bp）中有8个单倍型序列（表1），与GenBank下载的28个同源序列合并分析.结果表明，鳅属8种（亚种）36个Cytb单倍型序列的平均碱基组成为T 32.1%、C 24.8%、A 28.0%、G 15.1%，A+T含量（60.1%）高于C+G含量（39.9%），碱基组成表现出明显的T偏倚.其中，第1密码子位点C+G含量（50.3%）显著高于第2和第3密码子位点（分别为38.7%和30.7%）.

所分析序列共含有保守位点816个，约占序列总长（下同）的71.6%；变异位点数324个，约占28.4%；简约信息位点255个，约占22.4%.全部位点中不变位点有1 045个，转换位点有70个，颠换位点有17个，序列中的转换明显多于颠换，转换颠换比值（Ts/Tv）平均为4.13，序列突变未达到饱和.其中不变位点数第2密码子位点最多，有377个；而转换位点和颠换位点均是第3密码子位点最多，分别有58个和16个.

2.2 遗传距离

表2列出了基于Kimura双参数进化模型计算的鳅属种（亚种）间的平均遗传距离.结果显示，鳅属6种间平均遗传距离最大的是西伯利亚鳅（=北方鳅亚种）和黑龙江鳅（19.1%），四线鳅与韩鳅的最小（8.8%）；种间遗传距离明显大于花斑鳅亚种间的平均遗传距离（0.5%～2.6%）.在花斑鳅3个亚种中，亚种间的平均遗传距离最大值为河北花斑鳅指名亚种与西伯利亚鳅（=北方鳅亚种）（2.6%），其次是河北花斑鳅指名亚种与北方鳅亚种、俄罗斯花斑鳅指名亚种（均为1.9%），最小值为俄罗斯花斑鳅指名亚种与北方鳅亚种、格氏花鳅亚种（均为0.5%），该最小值接近于花斑鳅亚种内的平均遗传距离（0.1%～0.6%）.河北花斑鳅指名亚种与俄罗斯花斑鳅3个亚种间的平均遗传距离（1.7%～2.6%）明显大于俄罗斯花斑鳅3个亚种之间的平均遗传距离（0.5%～1.4%）.

表2 基于Kimura双参数进化模型的鳅属8种（亚种）间Cytb基因单倍型的平均遗传距离Tab.2 Averagegenetic distancesamong eight species（subspecies）of Cobitis for Cytb genehap lotypes according to Kimura-2-parametermodel%

2.3 分子系统进化树

应用贝叶斯法（BI法）和最大似然法（ML法）分别构建了鳅属鱼类的分子系统进化树（图1和图2），各分支的数字表示ML树中该支的bootstrap支持率和BI树中该支的后验概率.两系统树的拓扑结构基本一致，鳅属8种（亚种）36个个体分为2大类：第1大类（类群Ⅰ）由花斑鳅3个亚种和乔氏鳅以高置信度（BI 100%，ML 96%）聚在一起；黑龙江鳅、太平鳅、四线鳅和韩鳅4个种类聚为第2类群（类群Ⅱ）（BI85%，ML 82%）.

在类群Ⅰ中，分布于俄罗斯的北方鳅亚种、西伯利亚鳅亚种（=北方鳅亚种）、格氏花鳅亚种、花斑鳅指名亚种以及分布于我国辽宁的北方鳅亚种以低置信度（BI58%，ML 91%）聚为一支；分布于河北的花斑鳅指名亚种同样以较低置信度（BI64%，ML 80%）聚为另一支，然后这2支以高置信度（BI100%，ML 100%）聚在一起构成一大分支.与此分支构成姐妹群关系的是由韩国乔氏鳅和分布于我国黑龙江的北方鳅亚种以高置信度（BI 100%，ML 100%）聚在一起构成的分支.

图1 基于8种（亚种）鳅属鱼类Cytb基因单倍型构建的贝叶斯法（BI）分子系统树Fig.1 M olecular phylogenetic tree of 8（subspecies）speciesof Cobitis based on Cytb gene hap lotepes using Bayesian（BI）inferencemethod

图2 基于8种（亚种）鳅属鱼类Cytb基因单倍型构建的最大似然法（M L）分子系统树Fig.2 M olecular phylogenetic tree of8（subspecies）species of Cobitis based on Cytb gene hap lotypesusing maximum likelihood inference（M L）method

3 讨论

遗传距离分析显示，分布于河北的花斑鳅与分布于俄罗斯的花斑鳅3个亚种（花斑鳅指名亚种、北方鳅亚种和格氏鳅亚种）间的平均遗传距离为1.7%～2.6%，大于河北花斑鳅个体间的遗传距离（0.2%～1.1%），也大于俄罗斯花斑鳅3个亚种间的遗传距离（0.1%～1.5%）.遗传距离虽然不是物种的鉴别特征，但可以为物种的分类地位提供佐证[8].Bohlen等[24]基于Cytb基因序列对小亚细亚和巴尔干半岛鳅属鱼类的研究中，斑条鳅（C.punctilineata）和瘤鳅（C.strumicae）的遗传距离为1.9%.Perdices等[8]基于Cytb基因序列分析俄罗斯境内的花斑鳅指名亚种、北方鳅亚种和格氏鳅亚种的遗传距离（0.0%～1.3%），认为上述3个亚种的遗传距离与地中海淡水鱼类种内遗传距离（＜2%）[25]相近，并以此为依据，认为俄罗斯地区仅有1个种，无亚种分化.由此可见，从遗传距离来看，河北花斑鳅与俄罗斯花斑鳅之间的遗传分化应属于亚种级分化水平.

在系统进化上，分布于中国河北、辽宁和俄罗斯的花斑鳅以高置信度（BI 100%，ML 100%）聚为一支单系，其中分布于中国河北的花斑鳅聚为一支，而分布于辽宁和俄罗斯的花斑鳅聚为另一支，虽然两分支的置信度（分别为BI 64%和ML 80%；BI 58%和ML 91%）相对较低，但提示两者已有分化，系统发育关系的结果与遗传距离显示的结果一致.从地理起源和演化上看，鳅属鱼类从中新世，约15百万年前[26]由中国南方向北扩散，经中国东部、日本、朝鲜、蒙古到达欧洲和北非[27-28].花斑鳅分布广泛，从中国黄河以北到韩国、蒙古、俄罗斯至哈萨克斯坦均有分布[4].辽宁北方鳅亚种在地理分布上，介于河北花斑鳅和俄罗斯花斑鳅之间.系统进化上，辽宁北方鳅亚种与俄罗斯花斑鳅3个亚种具有较近的亲缘关系，遗传分化程度也支持二者聚为一支；辽宁北方鳅亚种与俄罗斯花斑鳅3个亚种的遗传分化（遗传距离为0.9%～1.4%）明显低于其与河北花斑鳅的遗传分化（遗传距离为1.7%～2.2%）.由于本研究中辽宁北方鳅亚种Cytb序列仅1条，不排除因序列少导致该亚种在系统树分析中位置有差异.但以上分析表明，河北花斑鳅与俄罗斯花斑鳅为亚种级分化水平.

俄罗斯花斑鳅亚种名为北方鳅（C.m.granoei）还是西伯利亚鳅（C.m.sibirica），国内外学者存在明显分歧.Berg[12]和Bǎcescu等[13]认为北方鳅是西伯利亚鳅的次定同物异名.但是，Nalbant等[14]、Vasil’eva[15]、Vasil’ev等[18]认为北方鳅是西伯利亚鳅的先定同物异名.Bogutskaya等[29]研究这2个种名的先定性时，认为北方鳅（C.t.granoei）刊载时间（于1935年10月16日刊载于《NaturaeNovitiates》）早于西伯利亚鳅（C.t.sibirica）（于1935年11月19日刊载于《Naturae Novitiates》）.因此，根据命名优先原则，俄罗斯花斑鳅亚种名为北方鳅亚种（C.m.granoei），分布于辽河以北至韩国、蒙古、俄罗斯和哈萨克斯坦；花斑鳅指名亚种（C.m. melanoleuca）分布于黄河以北至河北境内.按鳅属鱼类线粒体Cytb的进化速率为每百万年变化0.68～0.84的模型计算[8]，花斑鳅指名亚种和北方鳅亚种的分歧年代距今为2.50～3.09百万年.

本研究中，分布于中国黑龙江的北方鳅亚种与韩国乔氏鳅以高置信度（BI 100%，ML 100%）聚为一支单系，系统发育结果与遗传分化程度一致；黑龙江北方鳅亚种与其他花斑鳅亚种的遗传分化（平均遗传距离为14.1%～15.2%）已达到种的分化水平，而与韩国乔氏鳅的遗传分化（遗传距离为0.3%～1.1%）属于种内分化范围.因此，根据该研究的成果，黑龙江的北方鳅亚种应与乔氏鳅是同种，为我国的新纪录种，但需结合形态特征作进一步研究.

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（责任编校 纪翠荣）

Taxonom ic statusof three subspeciesof Cobitismelanoleuca based on sequencesofm itochondrial cytochrome b gene

CHEN Yongxia1，LIANGNa1，LIXiu1，PANXiaorui1，WUDayong2
（1. College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，Hebei Province，China；2. College of Life Sciences，Hengshui University，Hengshui 053000，Hebei Province，China）

The taxonomic status of three subspecies（Cobitismelanoleucamelanoleuca，C.m.granoei，C.m.gladkovi）of Cobitismelanoleuca was discussed based on the whole sequences ofmitochondrial cytochrome b gene taken as hereditary marker.The genetic distance was calculated by themethod of Kimura-2-parameter.The results showed that the individual genetic distance of C.m.melanoleuca in Hebei Province was 0.2%-1.1%;the average genetic distance among the three subspeciesof Cobitismelanoleuca in Russiawas0.1%-1.5%.And the average genetic distance between C.m.melanoleuc and the three subspeciesof Cobitismelanoleuca in Russiawas1.7%-2.6%.Themolecular phylogenic trees demonstrated that the speciesof Cobitismelanoleuca wasdivided into two distinctclades.One clade included eighthyplogroupsof C.m.melanoleuca in HebeiProvince;the other clade included the three subspecies in Russia and C.m.granoei in Liaoning Province in China. Based on the existing researches and the presentstudy，the conclusion was that C.m.melanoleuca only distributed in China and therewasonly one subspecies，i.e.C.m.granoei in Russia.The divergence time between these two subspecieswasabout 2.50-3.09Mya.

Cobitismelanoleuca；mitochondrial cytochrome b gene；hereditarymarker；genetic distance；taxonomic status

Q959.4

A

2015-04-25

国家自然科学基金资助项目（31372166）.

陈咏霞（1976—），女，副教授，主要从事鱼类分类、系统发育与生物地理学方面的研究.

1671-1114（2015）03-0001-06