金樱子乙醇提取物抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

李 玲，孟英才，肖水平，谭 洋，廖美芳，裴 刚*（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

金樱子乙醇提取物抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

李 玲，孟英才，肖水平，谭 洋，廖美芳，裴 刚*
（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

目的对金樱子乙醇提取物进行抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究。方法用β-胡萝卜素-亚油酸漂白法，DPPH和NO自由基清除实验来衡量金樱子乙醇提取物的抗氧化活性；用α-葡萄糖苷酶抑制实验来测定金樱子乙醇提取物抑制α-葡萄糖苷酶的活性。结果金樱子乙醇提取物随着浓度增加抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性逐渐增大，但弱于阳性对照品。结论金樱子乙醇提取物具有较好的抗氧化和一定的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，并且有助于将来进一步开发利用金樱子。

金樱子，乙醇提取物，抗氧化；α-葡萄糖苷酶

金樱子(Rosa laevigata Michx.)是蔷薇科蔷薇属植物,又名糖罐子、糖橘子、山石榴、刺梨子、刺榆子、灯笼果等[1]。金樱子喜阳，生长在山野、田间和河畔等灌木丛中。在我国分布广泛，主要产于湖南、江西、浙江、江苏、广东、广西和安徽等地。金樱子拥有多种药用价值，它的根能活血化瘀、排毒收敛，叶子可以消肿止痛，果实可利尿补肾。金樱子具有多种药用价值归根于其含有的多种生物活性物质，据文献报道，金樱子含有丰富的化学成分，包括多种维生素、微量元素、多糖、黄酮、三萜等[2-3]。多糖、黄酮和三萜类化合物是许多药用植物的有效成分，具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤和抗衰老等生物活性。

调查发现，糖尿病是一个患病率高的慢性终身性疾病，以血糖持续升高为主要特征[4]。2000年全球糖尿病患者已经超过1.7亿，并逐年呈增长趋势。糖尿病可以引起多种并发症，如糖尿病肾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病足等。目前，治疗糖尿病的途径多种多样，其中抑制α-葡萄糖苷酶能够有效降低餐后血糖的升高。另一方面，糖尿病可以引起机体内脂质过氧化状态的改变，如糖尿病机体的血浆脂质过氧化物含量增加，抗氧化酶活力下降[5]。生物体在氧化应激下，机体产生的自由基使体内氧化与还原不平衡，造成氧化损伤，诱发各种疾病[6]。所以抗氧化、清除自由基能够减少多种疾病的发生发展。

金樱子中丰富的化学成分，具有多种生物活性。将金樱子乙醇提取物进行抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性测定，对其预防与治疗糖尿病及其并发症具有重要意义。本文采用β-胡萝卜素漂白法、DPPH 和NO自由基清除实验来衡量金樱子乙醇提取物的抗氧化活性，用α-葡萄糖苷酶抑制实验来测定金樱子乙醇提取物抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

金樱子果实切碎去掉种子于55℃干燥而成。β-胡萝卜素 (Sigma),DPPH (1,1-二苯基-2-苦基肼基，梯希爱上海化成工业发展有限公司)，硝普钠(国药集团化学试剂有限公司)，α-葡萄糖苷酶(solarbio),其他均为分析纯试剂。

紫外分光光度仪UV1800PC（上海美谱达）。

1.2 方法

1.2.1 金樱子乙醇提取物的制备 2 kg干燥金樱子用80%乙醇浸泡24 h，过滤，滤液减压回收，得到金樱子乙醇提取物50 g，用于活性测定。

1.2.2 β-胡萝卜素-亚油酸漂白法 β-胡萝卜素是一种多烯色素，易被氧化而退去黄色，在反应介质中，亚油酸氧化产生过氧化物能使β-胡萝卜素氧化褪色，随着时间的延长，吸光度越小。抗氧化剂可以抑制β-胡萝卜素氧化褪色。参照文献[7]，精密称取0.2 mg β-胡萝卜素溶于1 mL氯仿中，加入20 mg亚油酸和100 mg吐温-80。混合均匀后，减压除去氯仿，加入50 mL蒸馏水，剧烈震荡，配成反应介质溶液。同时设置空白组，不加β-胡萝卜素，其他步骤同前。向试管中加入0.2 mL的样品溶液，浓度0.1～1 mg/mL,加入5 mL反应介质溶液，在50℃条件下水浴90 min。用紫外分光光度计，在470 nm波长下测定0 min和90 min的吸光度值。每个浓度平行测定3次。抗氧化活性的计算公式：

AC(0)=0 min对照品的吸光度值；AC(90)= 90 min对照品的吸光度值；AS(90)=90 min样品的吸光度值。

1.2.3 DPPH法 DPPH在溶液中是一种很稳定的氮中心的自由基，用于抗氧化成分的体外抗氧化活性评价。按照文献[8]的方法稍加修改。将2 mL不同浓度的样品乙醇溶液（0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL）和2 mL DPPH溶液(1×10-4mg/mL)加入同一玻璃具塞试管中摇匀，在室温下密闭静置20 min，用乙醇作为参比，用紫外分光光度计，在517 nm波长下测定吸光度。每个浓度平行3次。DPPH自由基清除公式：

A0为样品的吸光度；A1为不加样品时DPPH的吸光度；A2为加了样品后DPPH溶液的吸光度。

1.2.4 NO法 按照文献 [9]的方法稍加修改。取1 mL硝普钠溶液(5 mM)和1 mL不同浓度的样品乙 醇 溶 液 混 匀 （0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL），29℃温浴3 h。对照组无样品，其他同上。完毕后，加入1 mL格里斯试剂（包含1%对氨基苯磺酸，0.1%1-萘胺和2%磷酸的水溶液），摇匀，用紫外分光光度计，在550 nm条件下测定紫外吸收。每个浓度平行测3次。NO自由基清除公式：

Ac对照品的吸光度值；As样品的吸光度值。

1.2.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性 α-葡萄糖苷酶能将4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)水解产生4-硝基苯酚 (pNP)，pNP在水溶液中显黄色，在405 nm有最大吸收，通过测定pNP在405 nm的吸光度大小来判定脂肪酶的活力[10]。取pH6.8磷酸缓冲液配成的α-葡萄糖苷酶（1U/mL）溶液500 μL，与100 uL不同浓度的金樱子乙醇提取物溶液(16、31、63、125、250、500 ug/mL)混匀，50℃条件下水浴10 min，加入500 μl 4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷(0.3 mg/mL),50℃条件下水浴30 min，用紫外分光光度计在405 nm波长下测定其吸光度。以阿卡波糖为阳性对照。每个浓度平行测3次。α-葡萄糖苷酶抑制活性公式：

A0为样品的吸光度；A1为不加样品时酶催化后的吸光度；A2为加了样品酶催化后的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 β-胡萝卜素-亚油酸漂白法

β-胡萝卜素的褪色程度与抗氧化剂的抗氧化能力有关，抗氧化能力越强，褪色越少，吸光度值越大。根据公式(1)计算抗氧化活性，样品的抗氧化活性越强，样品组的吸光度值越大，即AS(90)越大，抑制率越大。由图1可以看出，在低浓度条件下，随着金樱子乙醇提取物浓度的增大，抗氧化活性逐渐加大。当浓度大于4 mg/mL时，抑制率几乎不增加。金樱子乙醇提取物的抗氧化活性比槲皮素的抗氧化活性低。

图1 金樱子乙醇提取物对β胡萝卜素的漂白作用

2.2 DPPH法

研究表明，机体产生的自由基能引起多种慢性疾病。在体内产生的自由基，能使细胞膜、DNA和脂质体等生物大分子损伤，从而引发炎症、脏器病变和肿瘤等多种疾病。自由基是引起氧化反应重要物质，所以清除自由基是抗氧化研究的不可缺少的部分。DPPH自由基在517 nm有最大紫外吸收，随着抗氧化物质浓度的增加，DPPH自由基被清除的越多，吸光度值越小，根据公式(2)，计算的清除率越大。从图2可以看出，金樱子乙醇提取物清除DPPH自由基能力与浓度呈正相关，但低于维生素C。 在实验测定的浓度范围内，清除率的增加斜率没有减少。

图2 金樱子乙醇提取物对DPPH自由基的清除作用

2.3 NO法

NO自由基是机体内重要的自由基，是神经传递的信号分子，能使血管平滑肌松弛等作用。NO自由基在体内分布广泛，当机体平衡失调，产生过量的NO自由基，会损伤细胞，引起炎症、癌症和其他疾病。所以使用NO自由基清除剂可以有效减少由NO自由基过量分泌产生的疾病。金樱子乙醇提取物是成分多的混合物，由NO自由基清除实验结果可以看出（如图3），金樱子乙醇提取物的NO自由基清除率随浓度的增大而增大，但相同浓度下低于维生素C。图中金樱子乙醇提取物曲线的斜率大于维生素C的斜率，在测定的高浓度下几乎接近维生素C的清除率。

图3 金樱子乙醇提取物对NO自由基的清除作用

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶抑制剂能在消化道中抑制α-葡萄糖苷酶，减少葡萄糖的释放，进而抑制葡萄糖的吸收，能在源头上减少血糖的升高。由公式(4)计算样品的抑制率，与α-葡萄糖苷酶抑制能力成正比。

由图4可以看出，金樱子乙醇提取物有较弱的α-葡萄糖苷酶抑制活性，从曲线的斜率上看，抑制活性与浓度呈正相关。并且在测定浓度范围内，抑制率远低于相同浓度下的阿卡波糖。

图4 金樱子乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3 结论

天然的、低毒的植物药越来越受科学家的关注与人们的青睐。金樱子乙醇提取物是一类成分复杂的天然混合物。用β-胡萝卜素-亚油酸漂白法，DPPH和NO自由基清除实验来衡量金樱子乙醇提取物的抗氧化活性；用α-葡萄糖苷酶抑制实验来测定金樱子乙醇提取物抑制α-葡萄糖苷酶的活性，结果说明了金樱子乙醇提取物有较好的抗氧化活性和一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用。可能由于其成分复杂，导致抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性低于对照品。同时也说明了金樱子在天然降糖药和抗氧化剂方面极具开发潜力。

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[3]肖凯军，刘晓红.金樱子果实的化学成分及其应用[J].现代食品与药品杂志，2006，16(4):1-3.

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[5]王振宇，刘 瑜，周丽萍.大果沙棘黄酮对糖尿病小鼠血脂与抗氧化水平的影响[J].食品科学，2010(7):297-301.

[6]王君明，崔 瑛，申玲玲，等.中药致药源性肝损伤的氧化应激机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(5):247-249.

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[10]钱 瑾，黎 明，吴嘉瑞，等.消渴丸中药成分对α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究 [J].中国实验方剂学杂志，2012，18(7):173-176.

（本文编辑 匡静之）

Antioxidative Activity and α-Glucosidase Inhibitory Activity of Ethanol Extract in Rosa laevigata Michx.

LI Ling,MENG Yingcai,XIAO Shuiping,TAN Yang,LIAO Meifang,PEI Gang*
（Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo study antioxidative activity and α-glucosidase inhibitory activity of ethanol extract from Rosa laevigata Michx. (R.laevigata).MethodsThe antioxidative activity of ethanol extract from R.laevigata were determinated by β-carotene-linoleic acid bleaching,DPPH and NO scavenging assay.And the α-glucosidase inhibitory activity of ethanol extract from R.laevigata was measured by α-glucosidase inhibitory assay.Results The ethanol extract from R.laevigata showed strong antioxidant activity and possessed α-glucosidase inhibiting capacity following the concentration increased,but the activities were lower than positve control.ConclusionIt was evident that the ethanol extract from R.laevigata showed certain antioxidant activity and α-glucosidase inhibiting capacity.It may be used for the future research on R.laevigata.

Rosa laevigata,ethanol extract,antioxidation,α-glucosidase

R284

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.12.004

2015－11－23

湖南省卫生厅225人才培养资助项目；2015年长沙市科技计划项目资助。

李 玲，女，副教授，主要从事天然产物新药研究与开发。

*裴 刚，男，教授，博士研究生导师，E-mail:peigang@hotmail.com。