不同葡萄糖浓度对霉菌产油能力的影响

梁 峰 王 莉，2 夏保密 宋兆齐，2 张淑红，2 刘秀花，2

（1.商丘师范学院 生物精炼河南省工程实验室，河南 商丘 476000；2.商丘师范学院 生命科学学院，河南 商丘 476000）

微生物油脂（microbial oils）又称单细胞油脂（single cell oil，SCO），是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物合成的一类物质。微生物油脂主要是由不饱和脂肪酸（PUFAs）组成的甘油三酯（TAG），在脂肪酸组成上与植物油（如菜籽油、棕榈油、大豆油等）相似。如果油脂积累量超过细胞总量的20%，即称为产油微生物［1］。微生物油脂的研究和开发，不仅丰富了传统的油脂工业技术，而且是工业化生产油脂的一个重要途径［2］。

目前，能够被用来生产油脂的微生物种类有酵母菌、霉菌、细菌和藻类等，其中以霉菌和藻类的真核生物居多。霉菌中脂肪酸类型要比酵母菌丰富，并含有丰富的γ-亚麻酸、花生四烯酸等多种不饱和脂肪酸［3］。同时，霉菌可以利用秸秆、食品工业废弃物等纤维素物质，分解产生单糖，并以此作为合成油脂的原料。在人口快速增长的情况下，研究并优化霉菌的产油条件，确定最经济高效的葡萄糖培养浓度，对于开辟新油源—微生物油脂具有重要的理论和实际意义［4］。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用的常现青霉P1（Penicillium flavidorsum）、土壤青霉P3（Penicillium terrestre）、绿色木霉L1（Trichoderma viride）、红色脉孢霉H1（Neurosporspp）均由本实验室收集保藏。

1.2 培养基

GMY 培养基［5］：磷酸二氢钾8g，硫酸镁0.5g，酵母提取 物3g，葡 萄 糖40g，水1L 调 至PH，5.5。GMY40、GMY60、GMY80、GMY100、GMY120（每升GMY 发酵液中葡萄糖的含量分别为40g、60g、80g、100g、120g），则发酵液中葡萄糖浓度分别为：4%、6%、8%、10%、12%。在115℃条件下高压蒸汽灭菌30min。

1.3 发酵条件

吸取1ml 无菌水，分别注入斜面培养的四株霉菌试管中，吹打，晃动试管；将孢子液吸到1.5ml 的离心管中，反复吹打，使孢子充分分散；用血球计数板进行孢子计数，若孢子浓度过高，则需要倍比稀释，最终保证每100ml发酵液的接种量为108个孢子［6］。在无菌条件下，分别接种P1、P3、L1、H1的孢子悬液于GMY40、GMY80、GMY120的发酵液中，在30℃、225r/min的条件下摇床培养3天，每隔24h进行定性定量检测，跟踪观察4天。

1.4 油脂滴染色与显微观察

采用苏丹黑染色方法进行染色，并通过显微镜拍照获得霉菌在不同培养时间积累油脂滴的状况［7］。

1.5 生物量的测定

每隔24h，利用真空水循环式抽滤泵，过滤收集菌丝体，再用真空冻干机冻干［8］。恒重后，得到菌体和称量瓶的总重m2；在收集菌体前，先恒重称量瓶，计为m1。那么，菌体的生物量M=m2-m1。

1.6 发酵液中残糖量的测定

在接种前，先用阿贝折射仪检测发酵液中初始糖含量，计为W1。在培养至1d、2d、3d、4d 时，分别吸取发酵液，利用阿贝折射仪检测发酵液中残余糖含量，计为W2。那么，消耗的葡萄糖量为：mG（消耗糖量）=W1-W2；葡萄糖转化为生物量的效率（%）=mb（生物量）/mG（消耗糖量）×100%［9］。

1.7 油脂含量的测定

油脂能溶于有机溶剂如乙醚、石油醚等，且有机溶剂具有易挥发性。索氏抽提器可以进行回流蒸发和蒸馏，反复抽提样品中的油脂［10］。菌体烘干，研磨粉碎后取一定重量的干菌体粉末用滤纸包好，放入索氏抽提器的提取管中，以30～60℃沸程的乙醚为抽提剂，取下抽提瓶，在80℃水浴中挥发掉残留石油醚，再置于95～105℃烘箱中烘干，准确称量粗油脂重量（m）［11-13］。

油脂含量（%）=m（油脂量）/M（生物量）×100%。

2 结果与讨论

2.1 霉菌在不同葡萄糖浓度下产油能力比较

培养3d，收获菌体，烘干后，利用索氏抽提法提取油脂，计算油脂产量（g/L）变化见表1。随着葡萄糖浓度的升高，四株霉菌的油脂产量逐渐减小，在4%的糖浓度下积累的油脂量最多。其中，L1的油脂产量最大。

表1 四株霉菌的油脂产量（g/L）及细胞油脂含量（%）

表1所示四株霉菌的油脂含量M（%）变化，可知，L1、P1、P3菌株在葡萄糖浓度为4%的发酵液中，油脂含量较高；H1 菌株在葡萄糖浓度为8%的发酵液中，油脂含量较高。L1 菌株油脂含量却最高，说明L1 合成油脂的能力最大。L1 和P1 菌体积累的油脂量与生物量呈正比，随着糖浓度的升高，生物量逐渐降低，油脂量也逐渐降低；P3 在4%的浓度下菌体合成油脂的能力最大；H1 在8%的糖浓度下积累的生物量较少，但合成油脂的能力却相对较大，与相关报道一致［14］。

图1 四株霉菌利用葡萄糖转化为油脂的效率

如图1 所示不同霉菌葡萄糖-油脂的转化率（%）差异。随着葡萄糖浓度的升高，四株霉菌的葡萄糖-油脂转化率均呈现降低趋势；在葡萄糖浓度为4%的发酵液中，L1菌株的葡萄糖-油脂转化率最高。随着葡萄糖浓度升高，霉菌转化糖的能力却下降，消耗的糖并没有转化为更多的油脂和生物量，而是被呼吸作用消耗掉。

2.2 菌株L1产油条件优化

2.2.1 L1在不同糖浓度下积累生物量的能力。为了确定最经济高效的葡萄糖浓度，使霉菌具有最佳的油脂合成能力，在葡萄糖浓度分别为4%、6%、8%、10%、12%的发酵液中，培养L1，进行形态学观察和定性定量检测。在1d、2d、3d、4d 时，分别收获菌体，干燥后恒重，测定生物量（g），如图2所示。

图2 L1在不同葡萄糖浓度条件下的生物量

从图4 可知，在葡萄糖浓度为4%的发酵条件下，L1菌体的生物量较大；在12%的糖浓度下，L1 的生物量最小；随着发酵时间的延长，菌体的生物量逐渐增加；在4d时，L1积累的生物量达到最大值。

2.2.2 菌体L1 在不同糖浓度条件下葡萄糖消耗差异。分别在1d、2d、3d、4d 时，吸取发酵液，测得残糖量，并计算L1在不同糖浓度下消耗的葡萄糖量，如图3所示。

图3 L1在不同糖浓度下消耗的葡萄糖量

由图3可知，随着发酵液中糖浓度的增加、培养时间的延长，L1 消耗的葡萄糖量也在增加。在4d 时，消耗糖最多，且L1在含糖量为8%、10%、12%的发酵液中消耗的糖量几乎持平。

图4 L1利用葡萄糖转化为生物量的效率

从图4可知，随着发酵液中葡萄糖浓度的增加，L1对葡萄糖-生物量的转化率逐渐减小。在葡萄糖浓度为4%时，L1 利用葡萄糖转化为生物量的效率最大。在3d 以后，糖浓度10%、12%的发酵液中，L1 对糖的转化率几乎持平。糖含量越高，L1消耗的葡萄糖量越多，积累的生物量却减少，说明L1只能利用一部分葡萄糖积累生物量。

2.2.3 不同糖浓度L1脂肪积累的差异。分别在培养1d、2d、3d、4d时，获得干菌体，利用索氏抽提法，得到L1在不同葡糖糖浓度条件下的油脂产量（g/L），如表2所示。

表2 L1的油脂产量（g/L）和细胞含油量

由表2可知，随着葡萄糖浓度的增加，L1菌体的油脂产量逐渐降低；随着培养时间的延长，油脂产量逐渐增加。在4d时，L1在葡萄糖浓度为4%的发酵条件下，具有最高的油脂产量。在3d 以后，L1 在糖浓度为6%、8%、10%的条件下油脂产量几乎持平，油脂积累已经达到最大值。在12%的糖浓度下，L1 的油脂产量在3d 最大，而在4d有所下降，油脂被分解消耗掉。随着培养时间的延长，油脂含量先升高后降低，在3d 时达到最大值，为38.62%。L1的油脂产量与生物量呈正比，随葡萄糖浓度的升高而降低，在高浓度的葡萄糖条件下油脂含量反而不高。

图5 L1利用葡萄糖转化为油脂的效率

由图5可知，随着葡萄糖浓度的升高，L1菌株利用葡萄糖转化为油脂的效率逐渐降低。在葡糖糖浓度为4%的发酵条件下，L1消耗较少的葡萄糖却产生较多的油脂，转化率最大。葡萄糖浓度越高，转化为油脂的效率却越低，说明高浓度的葡萄糖会抑制油脂的合成，大量的葡萄糖通过呼吸作用而消耗。

2.2.4 菌体L1 的细胞内油脂滴连续变化。葡萄糖浓度为4%、6%、8%、10%、12%发酵条件下，分别在1d、2d、3d、4d时，对L1的菌丝体进行苏丹黑染色。镜检结果如图6 所示。由图6 可知，在相同的发酵时间，葡萄糖浓度越高，L1菌体积累的油脂滴密度越低，含量越少。随着培养时间的延长，L1积累的油脂逐渐增多，在4d时，油脂滴变大数目变小。在4%的糖浓度条件下，油脂滴密度较大，含量较多。说明高浓度的葡萄糖反而不利于油脂的积累，甚至会抑油脂的合成能力。

图6 L1在不同葡萄糖浓度下的油脂滴染色结果

3 结语

本研究应用细胞形态学和细胞化学染色方法对霉菌进行跟踪观察，探究不同葡萄糖浓度的发酵条件对霉菌产油能力的影响。综上所述，葡萄糖浓度会明显影响霉菌的生物量、油脂积累量和葡萄糖转化率。随着葡萄糖浓度的升高，霉菌消耗的葡萄糖量逐渐增大，而霉菌的生物量并不一定增加；葡萄糖浓度越高，利用葡萄糖增加生物量和产生油脂的能力受到限制，大量的葡萄糖通过呼吸作用而被消耗，造成资源和能源的浪费。当培养基初始葡萄糖浓度过高，会出现明显的抑制作用，这可能是由于培养基的渗透压力随浓度的升高而增加，而到后期葡萄糖被消耗，渗透压的剧烈改变使菌体细胞不能耐受，导致菌体不能正常生长，继而影响代谢水平，造成发酵周期延长、产率降低。葡萄糖浓度过高会导致菌体自身的代谢非常旺盛，细胞内产生大量的有机酸，影响到微环境的pH，葡萄糖的代谢产物也会抑制其他产物的合成。

通过对不同葡萄糖浓度条件下，四株霉菌的生长状况和产油情况进行定性、定量分析，可以得出以下结论：四株霉菌中，L1的产脂能力最高；L1在葡萄糖浓度为4%的发酵条件下，油脂产量最佳为2.598g/L，油脂含量为38.62%，具有最大的油脂合成能力，且较低浓度时油脂积累较好，预示工业发酵可采用流加的工艺，下一步将就此开展研究。然而，本研究发酵底物为葡萄糖，当底物替换为其他糖（如木糖）或者混合糖时产油能力如何？这个问题将在后续研究中继续探讨。

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