苦参素对人肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响及其机制

史卫林，李坚，陆建保，陈萍，周玉涛

（1.溧阳市人民医院呼吸内科，江苏溧阳213300；2.江苏大学附属医院呼吸内科，江苏镇江212001）

苦参素对人肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响及其机制

史卫林1，李坚2，陆建保1，陈萍2，周玉涛1

（1.溧阳市人民医院呼吸内科，江苏溧阳213300；2.江苏大学附属医院呼吸内科，江苏镇江212001）

目的：观察苦参素联合放射线照射对人肺腺癌A549细胞增殖率以及DNA依赖性蛋白酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PK）的两类结构亚基DNA-PKcs及Ku80 mRNA表达的影响。方法根据不同的处理条件，将A549细胞分为对照组，单纯照射组，单纯药物组，药物联合照射组。通过CCK-8法检测细胞增殖率，并应用实时荧光定量PCR技术检测DNA-PKcs及Ku80 mRNA的相对表达水平。结果：苦参素明显抑制A549细胞的增殖，呈时间和剂量依赖性（P＜0.05），其24 h和48 h的半数抑制浓度（IC50）值分别为3.2 g/L和2.4 g/L。单纯照射组随着照射时间的延长和放射线剂量的增加，细胞增殖率明显下降（P＜0.05）；药物联合照射组细胞随着照射时间的延长，细胞增殖率也随之明显下降（P＜0.05）；在同一时间点，药物联合照射组细胞增殖率下降比单纯照射组更为明显（P＜0.05）。此外，在单纯照射组中，A549细胞DNA-PKcs及Ku80 mRNA的相对表达水平随着照射时间的延长和放射线剂量的增加而增高（P＜0.01）；较对照组而言，单纯药物组DNA-PKcs及Ku80 mRNA的相对表达水平明显下调（P＜0.01）；与对应的单纯照射组比较，药物联合照射组DNA-PKcs及Ku80 mRNA相对表达水平明显下调（P＜0.01）。结论：苦参素对肿瘤细胞具有放射线增敏作用。辐射可明显增加肺癌细胞DNA-PKcs及Ku80 mRNA的相对表达水平，苦参素对A549细胞的放射线增敏效应至少部分是与抑制DNA-PKcs及Ku80 mRNA的表达，从而抑制DNA损伤修复有关。

肺癌；苦参素；放射敏感性；DNA依赖性蛋白酶

放疗是中晚期肺癌患者的一个重要治疗手段。肿瘤细胞受到放射线照射后主要发生碱基损伤、DNA单链断裂、DNA双链断裂以及DNA-蛋白质交联等损伤，其中最主要是双链断裂，而细胞可以修复双链断裂从而对放射线产生放疗耐受。现有研究认为DNA依赖性蛋白酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PK）通过修复双链断裂，影响细胞对放射线的敏感性［1］。DNA-PKcs及Ku80是DNA-PK的结构亚基，参与DNA非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）修复，是研究肿瘤细胞放疗敏感性的重要靶点。近年来，虽然肿瘤放疗技术已取得较大进展，但仍有部分患者放射治疗失败。而且对放射治疗有效的患者复发后再放疗效果常常不明显，究其原因主要与肿瘤细胞对放射线耐受有关。苦参素是中药苦参的主要活性成分之一，具有放疗增敏作用［2］，但机制尚未阐明。本实验通过观察苦参素联合放射线照射对肺癌A549细胞增殖率以及DNA-PKcs、Ku80 mRNA表达的影响，探讨苦参素放疗增敏的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DMEM培养基和0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司），苦参素标准品（北京中科仪友化工技术研究院），CCK-8试剂盒（生工生物工程上海股份有限公司），Trizol试剂盒（美国Invitriogen公司），反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），倒置式生物显微镜（日本奥林巴斯公司），Clinac 600c 6MV直线加速器（美国Varian公司），HT-2型酶标仪（Austria公司），荧光定量PCR分析仪（美国Stratagene公司），人肺腺癌A549细胞株由江苏大学医学院提供。

1.2 苦参素作用于A549细胞后细胞增殖率的测定

取对数生长期的A549细胞，接种至96孔板，每孔100μL（细胞数约5×103/孔），每一实验组（按苦参素浓度）设6个复孔，培养12 h后移液枪小心吸取上清液，分别将含有苦参素质量浓度为0，0.5，1.0，2.0以及4.0 g/L的培养基100μL加入对应的孔中，其中0 g/L设为阴性对照组，同时设立空白组。然后置于37℃、5%CO2培养箱孵育，分别在培养24 h和48 h后于对应的各孔中加CCK-8试剂10 μL，继续于37℃恒温条件下培养1 h，酶标仪上测定450 nm处光密度（D）值。实验重复3次。用空白组调零后，计算各组细胞增殖率（细胞增殖率=实验组D值/对照组D值×100%）。

1.3 单纯照射和药物联合放射线作用后细胞增殖率的测定

根据细胞抑制率，利用SPSS 17.0软件计算出半数抑制浓度（IC50）值，选择48 h 20%抑制浓度（IC20）值0.9 g/L作为加药浓度。将处于对数生长期的A549细胞分为对照组，单纯照射组，药物联合照射组，照射剂量分为1，2，4和8 Gy。在24 h和48 h分别测定细胞增殖率，测定方法同上。

1.4 实时荧光定量PCR法检测细胞DNA-PKcs及Ku80 mRNA的表达

将处于对数生长期的A549细胞分为对照组，单纯照射组，单纯药物组，药物联合照射组，照射剂量分为1，2，4和8 Gy，单纯药物组与药物联合照射组中苦参素质量浓度选定为0.9 g/L。根据实验分组，接种细胞，在药物及射线干预后的24，48 h收集细胞，使用Trizol试剂提取RNA，测定RNA浓度，然后进行反转录，最后进行PCR扩增。扩增条件：95℃5 min预变性，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。GAPDH：上游引物5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′，下游引物5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′，产物长度172 bp；DNA-PKcs：上游引物5′-ATCTGTCATCTGCTGTGTCTTCAAT-3′，下游引物5′-CTGCTTCTCTGGCTTCTTTCCTAA-3′，产物长度197 bp。Ku80：上游引物5′-GCTAATCCTCAAGTCGGCGT-3′，下游引物5′-ATGGAGTCAATCAAAGCATCAACA-3′，产物长度182 bp。以GAPDH作为内参照，定量分析DNAPKcs及Ku80 mRNA的相对表达水平。目的基因相对表达水平的计算公式：2-ΔΔCt=2-（ΔCt目的基因-ΔCt标准值）。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 苦参素对A549细胞增殖率的影响

不同质量浓度的苦参素处理A549细胞后，细胞增殖率随苦参素作用时间的延长及浓度的增大而下降，呈时间（P＜0.05）和剂量依赖性（P＜0.05）。4种质量浓度的苦参素作用后细胞的增殖率见图1。24 h的IC50值为3.2 g/L，48 h的IC50值为2.4 g/L，48 h的IC20值为0.9 g/L。

图1 不同质量浓度苦参素作用后A549细胞的增殖率

2.2 单纯照射和药物联合照射处理对A549细胞增殖率的影响

如图2所示，当药物联合照射组中苦参素质量浓度设定为0.9 g/L时，随着照射时间的延长和照射剂量的增加，单纯照射组和药物联合照射组的A549细胞增殖率明显下降（P＜0.05）；在同一时间点，与对应的照射组比较，药物联合照射组的细胞增殖率明显下降（P＜0.05）。以上结果表明，苦参素可明显增加A549细胞对放射线的敏感性。

图2 不同放射线剂量对两组A549细胞增殖率的影响

2.3 单纯照射和药物联合照射作用后A549细胞DNA-PKcs和Ku80 mRNA的相对表达水平

与对照组（对照组中DNA-PKcs和Ku80 mRNA的表达量设定为1）比较，单纯照射组DNA-PKcs和Ku80 mRNA的相对表达水平随着时间的延长和照射剂量的增加明显增高（P＜0.01），见表1、表2。单纯药物组的DNA-PKcs和Ku80 mRNA相对表达水平比对照组明显下降（P＜0.01）；在同一时间及同一放射线剂量，药物联合照射组的DNA-PKcs和Ku80 mRNA相对表达水平较单纯照射组显著降低（P＜0.01），见表3、表4。结果提示，放射线可以诱导A549细胞DNA-PKcs和Ku80基因表达的增加，而苦参素可下调A549细胞的DNA-PKcs和Ku80 mRNA表达水平。

表1 4种剂量X射线处理后A549细胞DNA-PKcsm RNA的相对表达水平

表2 4种剂量X射线处理后A549细胞Ku80 m RNA的相对表达水平

表3 5种剂量X-射线联合苦参素（0.9 g/L）处理后A549细胞DNA-PKcsmRNA的相对表达水平

表4 5种剂量X射线联合苦参素（0.9 g/L）处理后A549细胞Ku80 m RNA的相对表达水平

3 讨论

苦参素（氧化苦参碱）来源于豆科植物苦参的干燥根，是中药苦参的主要生物碱。近年来研究发现，苦参素有多方面的药理活性，其中抗肿瘤作用受到了广泛关注。它能够抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡，抑制肿瘤新生血管形成和肿瘤侵袭［3-8］。也有少量报道表明其有放疗增敏作用［2］，但机制不甚清楚。本实验结果显示，苦参素能够抑制A549细胞的增殖，这一作用呈时间和剂量依赖性。而且与单纯照射组比较，苦参素联合照射组的A549细胞增殖率明显降低，表明苦参素可增加肺腺癌细胞对放射线的敏感性。

DNA是放射线作用的主要靶点，放射线的直接作用和电离效应产生的自由基共同导致DNA单、双链断裂损伤，其中以双链断裂为放射线杀伤肿瘤细胞最重要的机制。当DNA双链受到损伤时，细胞将通过不同的途经启动应答进行DNA修复以克服损伤。在哺乳动物细胞中，双链断裂修复有两条途径：同源性重组（homologous recombination，HR）和NHEJ，其中NHEJ途径是主要修复途径［9］。DNAPKcs基因位于染色体8q11，编码相对分子质量为469 000的蛋白质，其C-末端结构域和参与信号传导的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）有同源性［10］。人Ku80基因位于染色体2q33-34，编码相对分子质量约为86 000的蛋白，参与DNA-PK与其他蛋白的相互作用，它与Ku70紧密结合，形成Ku蛋白［11］。当DNA双链损伤时，2个Ku分子特异性地连接到DNA双链损伤处，分别识别并结合于每一条DNA链末端，然后以ATP依赖的方式沿DNA链分别向两端滑动一小段距离，同时Ku本身具有的弱解旋酶活性使两个断端局部解链，从而形成Ku-DNA复合物吸引DNA-PKcs到损伤部位，位于两个断裂末端的DNA-PK蛋白复合体通过各自的氨基端相互作用搭桥，拉近DNA损伤末端，并激活DNA-PKcs的丝/苏氨酸激酶活性，磷酸化参与NHEJ的一系列蛋白质，对DNA损伤位点进行恰当的剪切和连接，当修复完成后DNA-PK发生自身磷酸化，使2个亚单位从DNA链上解离［12-13］。作为DNA-PK复合物的主要功能单位，DNA-PKcs与Ku80是研究肿瘤细胞放疗敏感性的重要靶点。

大量研究显示，DNA-PKcs和Ku80基因或者蛋白高表达的肿瘤细胞对放射线耐受，而低表达则对放射线高度敏感［14-15］。有研究显示，通过抑制肿瘤细胞DNA-PKcs的表达或抑制其磷酸化，或者抑制Ku80的表达，均可提高肿瘤细胞对放射线的敏感性［16-21］，说明DNA-PKcs和Ku80的表达水平是影响细胞对放射线敏感性的重要因素。本实验结果显示，单纯用放射线照射后随着照射时间的延长，照射剂量的增强，肺腺癌细胞DNA-PKcs和Ku80 mRNA的相对表达水平相应增加。这一结果表明，放射线在杀伤肺癌细胞的同时也诱导了DNA-PKcs和Ku80基因的表达增加，NHEJ通路的DNA损伤修复功能被激活，以抵抗放射线对肺癌细胞DNA的损伤作用，同样证明了DNA-PKcs和Ku80在肺腺癌细胞对放疗的耐受中起着重要作用，其表达水平可以作为预测肿瘤对放疗敏感性的标志。我们的实验结果还显示，单纯药物组中DNA-PKcs和Ku80 mRNA的表达水平下调，药物联合照射组与对应的单纯照射组相比较，其相对表达水平明显下调，这也表明了苦参素可下调肺腺癌细胞DNA-PKcs和Ku80的表达水平，通过抑制DNA的修复功能，增加细胞对放射线的敏感性，这也可能是其放疗增敏机制之一。

综上所述，苦参素具有放射线增敏作用，其增敏机制之一可能是通过下调DNA-PKcs和Ku80的表达，抑制细胞DNA损伤的修复功能。苦参素放射线增敏作用的确切机制仍需进一步深入研究。

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Effect of oxymatrine on radiosensitivity of A549 cells and its possiblemolecular mechanism

SHIWei-lin1，LI Jian2，LU Jian-bao1，CHEN Ping2，ZHOU Yu-tao1
（1.Department of Respiratory Medicine，the People′s Hospital of Liyang City，Liyang Jiangsu 213300；2.Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To investigate the mechanism of oxymatrine in enhancing the sensitivity of lung cancer cells to radiation.M ethods：The A549 cellswere divided into control group，radiation group，drug group，drug plus radiation group according to treatment condition.The cell counting kit-8 assay was used to determine proliferation rate.The real-time quantitative PCR assays were conducted tomeasure DNA-PKcs and Ku80 mRNA expression levels at 24 h and 48 h following treatment with oxymatrine，or radiation，or oxymatrine plus radiation.Results：Oxymatrine significantly inhibited the proliferation of A549 cells in a dose and time dependentmanner（both P＜0.05）.IC50of A549 cells for oxymatrine at24 h and 48 h were 3.2 g/L and 2.4 g/L，respectively.The proliferation rates of A549 cells in the radiation group were decreased in a time and dose dependentmanner（both P＜0.05）.At the same time points，the cell proliferation rates in the drug plus radiation group were dropped markedly when compared with the radiation group（P＜0.05）.Additionally，the relative expression levels of DNA-PKcs and Ku80 mRNA were increased in a dose and time dependentmanner in the radiation group（both P＜0.01）.The relative expression levels of DNA-PKcs and Ku80mRNA in the drug plus radiation group were reduced significantly as compared with inthe radiation group（P＜0.01）.Conclusion：Oxymatrine enhanced the sensitivity of A549 cell to radiation，at least partially，by inhibiting DNA-PKcs and Ku80 mRNA expression and damage of DNA damage repairmechanisms.

lung cancer；oxymatrine；radiosensitivity；DNA dependent protein kinase

R734.1 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1671-7783（2015）03-0207-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150083

溧阳市科技计划项目（溧科发［2013］5）；江苏大学医学临床科技发展基金资助项目（JLY20120116）

史卫林（1982—），男，江苏溧阳人，主治医师，主要从事肺癌分子诊断研究。

2015-04-04 ［编辑］陈海林