JNK/c-Jun信号通路参与介导EB病毒编码的BARF1基因上调胃癌细胞Bcl-2的表达

张宇琼，张雪怡，徐美琴，褚福营，成静，陈巧林，周天戟

（江苏大学医学院，江苏镇江212013）

JNK/c-Jun信号通路参与介导EB病毒编码的BARF1基因上调胃癌细胞Bcl-2的表达

张宇琼，张雪怡，徐美琴，褚福营，成静，陈巧林，周天戟

（江苏大学医学院，江苏镇江212013）

目的：探讨EB病毒编码的BARF1基因对胃癌细胞JNK-MAPK信号通路活性及Bcl-2基因表达的影响。方法：以pSG5空载体转染的胃癌细胞系BGC823（BGC-SG）为对照，采用蛋白质印迹分析稳定表达BARF1的BGC823细胞（BGC-BARF1）中，以及采用JNK-MAPK的特异性抑制剂SP600125处理后JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平以及c-Jun和Bcl-2蛋白的表达。结果：与BGC-SG相比，BGC-BARF1细胞中JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平，以及c-Jun和Bcl-2蛋白的表达均显著提高（P＜0.05）。SP600125处理后，c-Jun蛋白的磷酸化水平以及c-Jun和Bcl-2蛋白的表达均显著下降。结论：JNK/c-Jun信号通路参与介导BARF1上调胃癌细胞中Bcl-2的表达。

BARF1；EB病毒；胃癌；JNK；Bcl-2

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）属于γ-疱疹病毒亚科，1964年由Epstein和Barr首次从非洲儿童的淋巴瘤细胞中分离得到。研究表明，EB病毒是一种致瘤性病毒，与其相关的恶性肿瘤包括鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）、胃癌（gastric carcinoma，GC）、伯基特淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma，BL）和霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s disease，HD）。EB病毒阳性的胃癌称为EB病毒相关胃癌，约占全球胃癌的10%［1-3］，但EB病毒在其中的作用还不是十分清楚，普遍认为与病毒编码的蛋白密切相关。BARF1是EB病毒编码的一个癌基因，存在于几乎所有的EB病毒相关胃癌中，具有抑制上皮细胞凋亡、促进其永生化和转化的作用［1，4-5］。转录激活因子激活蛋白-1（AP-1）主要是由c-Fos和c-Jun组成的异二聚体复合物，其中c-Jun是最重要的转录因子。作为一个癌蛋白，c-Jun在调控细胞的增殖、分化、侵袭和凋亡方面起关键作用。作为c-Jun转录因子的上游信号，JNK（c-Jun氨基末端激酶）-MAPK信号通路不仅可以在蛋白水平促进c-Jun的表达，而且激活的MAPK信号通路还可使c-Jun蛋白发生磷酸化，从而极大地提高c-Jun的转录活性，因而是细胞凋亡和生长控制的主要信号途径。Kume等［6］发现EB病毒相关胃癌组织中存在细胞凋亡抑制和Bcl-2蛋白的过表达。Sheng等［5］研究表明，BARF1能够激活Bcl-2蛋白过表达从而抑制凋亡。而Wang等［3］发现，BARF1能够促进胃癌细胞c-Jun的表达。因此，我们提出假说认为，BARF1通过激活JNK-MAPK信号通路上调胃癌细胞Bcl-2基因的表达，本研究旨在对其进行证伪。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

人胃癌细胞系BGC823购自中国科学院细胞库，pSG5载体以及pSG5-BARF1稳定转染的细胞克隆BGC-SG和BGC-BARF1各3个，由本室构建与保存，经RT-PCR鉴定，BARF1表达正常。DMEM、胎牛血清（Gibco公司），兔抗JNK、p-JNK、c-Jun、pc-Jun、Bcl-2抗体（Bioworld公司），RIPA裂解液、ECL化学发光试剂、鼠抗β-肌动蛋白抗体，JNK特异性抑制剂SP600125（碧云天生物技术研究所），湿式电泳转移系统和Quantity One图像分析软件（Bio-Rad公司），PVDF膜（Millipore公司），化学发光成像分析仪ImageQuant LAS 4000（GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将BGC-SG和BGC-BARF1置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM中，培养于37℃、5%CO2培养箱中。2～3 d更换1次培养液，待细胞长至75%左右，用含0.1%胰酶的PBS消化传代。取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 蛋白质印迹法检测细胞蛋白表达 细胞培养至密度为75%左右，抑制实验则换加含50μmol/ L的SP600125或DMSO继续培养12 h。用RIPA裂解液提取细胞总蛋白后，采用12%的凝胶进行SDS-PAGE，再以300 mA恒流转印至PVDF膜。以含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h。分别加入兔抗Bcl-2、c-Jun、p-c-Jun、JNK1/2/3及p-JNK1/2/3抗体（1∶1 000稀释），4℃孵育过夜，次日以TBST洗3次，10 min/次，加入HRP标记的羊抗兔IgG（1∶4 000稀释），室温孵育1 h，TBST洗3次，10 min/次，加入ECL显色液于化学发光成像仪中显影。PVDF膜洗去一抗及二抗后，重新与β-肌动蛋白抗体（1∶4 000）及HRP标记羊抗鼠IgG（1∶5 000）反应。显影图像以Quantity One软件分析蛋白条带密度值，经β-肌动蛋白校正上样量后进行统计分析。

1.3 统计分析

采用GraphPad Prism（Version 5.0）软件进行统计分析，实验数据以均数 ±标准差（±s）表示，组间均数的比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BARF1激活胃癌细胞中JNK/c-Jun信号通路

蛋白质印迹检测结果显示，BGC-BARF1细胞中c-Jun的蛋白表达、c-Jun和JNK蛋白的磷酸化水平均显著高于BGC-SG对照（t=9.561，4.269和4.331，P＜0.05），而总JNK无显著变化（图1、图2）。采用SP600125处理BGC-BARF1细胞后，c-Jun蛋白的表达和磷酸化水平均显著下降（t=5.098和5.782，P＜0.05），见图3。

2.2 JNK/c-Jun信号参与介导BARF1上调Bcl-2基因的表达

蛋白质印迹结果显示，BGC-BARF1细胞中Bcl-2蛋白的表达显著高于BGC-SG细胞（t=3.386，P＜0.05），见图4 A、B。采用SP600125处理后，BGC-BARF1细胞中Bcl-2蛋白的表达显著下降（t=3.349，P＜0.05），见图4 C、D。

图1 BGC-BARF1细胞中c-Jun蛋白的表达和磷酸化水平

图2 BGC-BARF1细胞中JNK蛋白的磷酸化水平

3 讨论

BARF1基因位于EB病毒基因组的BamHI-A片段内，编码一个含221个氨基酸、相对分子质量为（29～33）×103的分泌蛋白。研究表明，BARF1基因可促进人胃癌细胞和永生化上皮细胞的增殖［2，7］。多项研究证实BARF1通过上调Bcl-2的表达而抑制细胞的凋亡［3，6］，但其机制尚不十分清楚。我们最近的研究结果显示，BARF1可通过调节NF-κB信号通路上调Bcl-2的表达而抑制鼻咽癌细胞的凋亡［8］。本研究发现，BARF1能促进胃癌细胞c-Jun蛋白的磷酸化。c-Jun的磷酸化可增强其与其他转录因子形成二聚体后的转录活性。由于c-Jun的磷酸化最先触发了AP-1的激活，AP-1又能反过来激活c-Jun的启动子从而促进其表达［9］，故而我们发现c-Jun蛋白的表达水平也显著增加。

图3 SP600125处理后BGC-BARF1细胞中c-Jun蛋白的表达和磷酸化水平

图4 BGC-BARF1细胞中以及SP600125处理后Bcl-2蛋白的表达

AP-1蛋白是由亮氨酸拉链（basic region-leucine zipper，bZIP）蛋白组成的同源或异源二聚体，在哺乳动物中主要由Jun家族成员如c-Jun、JunB和Fos家族成员如c-Fos、FosB等组成。AP-1蛋白通过与靶基因的DNA结合而激活其转录活性，参与细胞增殖、凋亡与分化，以及免疫炎症反应与肿瘤形成等一系列病理生理过程［9］。c-Jun是AP-1家族的基本成员，同时也是最强大的转录激活因子。c-Jun/AP-1蛋白作为一个癌蛋白在卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、子宫颈癌及肺癌等多种肿瘤中都呈过表达状态［10-11］，并已被证明对肝癌和皮肤癌的发展起决定性作用［12-13］。c-Jun的活性受多种因素的调节，其中，JNK能够与c-Jun的特定转录激活序列结合而促使其磷酸化。JNK是MAPK家族成员之一，属于高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。JNK蛋白激酶由3个同源性基因编码：JNK1、JNK2和JNK3，这些基因通过选择性剪接产生了10种异构体，这些异构体的共同基序是苏氨酸-脯氨酸-酪氨酸（T-PY），与其激活有关。当受到外界刺激时，MEKK4/ JNKK1和MEK7/JNKK2可介导JNK的Thr183和Tyr185磷酸化而激活JNK，使其具有酶催化活性［14］。本研究发现，BARF1能够通过提高胃癌细胞中JNK的磷酸化水平而激活JNK/MAPK信号通路。激活的JNK能够促使c-Jun转录因子Ser73和Ser63位点的磷酸化，从而提高其转录活性。活化后的c-Jun参与形成AP-1转录因子进入到细胞核内参与调控多种蛋白。当加入JNK1/2/3的特异性抑制剂SP600125后，c-Jun蛋白的表达和磷酸化水平均显著下降，提示JNK受BARF1激活后可促进c-Jun蛋白的合成以及磷酸化修饰，增强了AP-1的活性，以及下游靶基因的表达。

Bcl-2是Bcl-2蛋白家族中最重要的抗凋亡成员，能保护细胞免受凋亡，从而增加细胞染色体畸变和病毒感染的机会，导致细胞恶变和肿瘤形成。在前列腺癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肾癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、急慢性白血病以及皮肤癌等多种人类肿瘤中都发现了Bcl-2的异常表达［15-16］。本研究中，我们在进一步证实BGCBARF1中Bcl-2过表达的基础上，发现JNK抑制后，Bcl-2的表达显著下降，说明BARF1通过激活JNK/ c-Jun信号通路引起了其下游靶基因Bcl-2的表达增高。

综上所述，本研究结果表明，JNK/c-Jun信号通路参与介导了BARF1上调胃癌细胞原癌基因Bcl-2的表达，从而抑制了其凋亡。然而，信号通路网络错综复杂，是否还有其他信号通路参与介导了BARF1诱导胃癌细胞的凋亡抑制以及增殖的过程，还有待于进一步研究。

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JNK/c-Jun signaling pathway contributes to mediate Epstein-Barr virus-encoded BARF1 gene up-regulating Bcl-2 expression in human gastric carcinoma cells

ZHANG Yu-qiong，ZHANG Xue-yi，XU Mei-qin，CHU Fu-ying，CHENG Jing，CHEN Qiao-lin，ZHOU Tian-ji
（School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the effect of the JNK/c-Jun signaling pathway on mediating Epstein-Barr virus-encoded BARF1 gene up-regulating Bcl-2 expression in human gastric carcinoma cells.M ethods：Western blotting was performed to analyze the levels of JNK and c-Jun protein phosphorylations and of the total c-Jun and Bcl-2 protein expressions in BARF1-stably-expressing human gastric carcinoma cell line BGC823（BGC-BARF1）under the control of pSG5 vector transfected one（BGC-SG）.Results：The levels of the JNK and c-Jun protein phosphorylations，and of the c-Jun and Bcl-2 protein expressions were significantly increased in BGC-BARF1 compared with the BGC-SG controls，and blocked by special inhibitor of JNK-MAPK SP600125（all P＜0.05）.Conclusion：JNK/c-Jun signaling pathway contributes to mediate BARF1 gene up-regulating the Bcl-2 expression in human gastric carcinoma cells.

BARF1；Epstein-Barr virus；gastric carcinoma；JNK；Bcl-2

R735.2 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1671-7783（2015）03-0199-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150046

江苏大学高级技术人才科研启动基金资助项目（06JDG011）

张宇琼（1990—），女，硕士研究生；周天戟（通讯作者），教授，硕士生导师，E-mail：zhoutj64@ujs.edu.cn

2015-03-17 ［编辑］ 何承志